Buscador

Encontrado(s) 2216354 resultado(s)
Encontrada(s) 221636 página(s)

Caracterització de l'activitat i el fenotip de la proteasa del VIH-1 mitjançant un sistema de cribratge genètic basat en el bacteriòfag lambda

  • Cabana Sumsi, Marta
Els inhibidors de la transcriptasa inversa vírica i de la proteasa, són dos tipus de fàrmacs àmpliament utilitzats en la lluita contra el virus de la immunodeficiència humana tipus-1 (VIH-1). Un correcte ús i disseny dels tractaments, pot conduir a una inhibició sostinguda de la replicació vírica, tot i que, no a una eliminació de la infecció. Un dels majors obstacles de la teràpia, és l'aparició de mutacions en el genoma víric, associades a una disminució de l'eficàcia terapèutica. Les pròpies característiques del VIH afavoreixen l'aparició d'aquestes mutacions que faciliten la imposició de variants capaces d'escapar a les situacions adverses, com pot ser la presència d'un fàrmac antiretroviral. En aquest treball s'han analitzat l'efecte que una major o menor inhibició de la replicació vírica pot tenir sobre l'evolució vírica i l'aparició de mutants de resistència. Dels resultats dels treballs realitzats vam poder concloure que, el nivell de supressió de la replicació vírica, condiciona la facilitat d'aparició de mutacions associades a resistència, malgrat l'existència d'evolució genètica. També es va analitzar l'ús d'un sistema de cribratge genètic basat en el bacteriòfag lambda. Aquest sistema va ser dissenyat per l'anàlisi de proteases específiques pel lloc de tall, com és la proteasa del VIH-1. Tant l'acitivitat com la susceptibilitat als inhibidors de la proteasa són dos paràmetres importants a determinar de les diverses variants genètiques d'aquest enzim. Així vam veure que aquest sistema era útil per l'anàlisi de proteases obtingudes de mostres de pacients i permetia preveure la resposta a un posterior canvi de tractament. Altrament era molt sensible a la detecció de variacions en l'activitat proteolítica induida per canvis simples en la cadena aminoacídica, així com també permetia detectar canvis en la sensibilitat als diversos inhibidors de la proteasa. En resum doncs, vam concloure que, el sistema de cribratge basat en el bacteriòfag lambda constituiex una bona eina per a la caracterització de proteases del VIH-1 rellevants clínicament, així com, per la profundització en l'estudi i caracterització d'aquesta proteïna i les seves variants., Inhibitors of protease and reverse transcriptase, are both widely used as drugs for threatment of human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) infection. A correct use and design of threatments can reach an inhibition of viral replication during long periods of time. One of the major problems of therapy is the appearance of mutations in the viral genome associated with a diminution of therapy efficacy. The easy incorporation of mutations during replication of HIV-1, allowed the appearance of scape mutants. Here we evaluated how the level of viral replication can afect the appearance of genotipic resistance. We concluded that the level of supresion of viral replication conditionate the appearance of resistance associated mutations despite the existence of genetic evolution. We also evaluated the use of a bacteriophage lambda-based genetic screening system. This system was designed to evaluate cleavage site specific proteases as HIV-1 protease. The activity and drug susceptibility are two parameters important of HIV-1 protease variants. We found the system useful for the analysis of HIV-1 proteases from patient samples and was useful too, to predict the efect of a new therapy. The system was also very sensible to detect changes of the proteolytic activity due to simple genetic mutaions. In summary, we concluded that the lambda-based genetic screening system was a good tool to characterisate HIV-1 proteases clinically important, as was for the further study and characterisation of this protein and its variants.

Proyecto:

Identificación y caracterización de nuevos genes implicados en el desarrollo del cáncer de próstata

  • Benedit Hernández, Patricia
El cáncer de próstata es una de las enfermedades con mayor índice de mortalidad en la población masculina. En los últimos años, hemos comprendido que para combatir esta enfermedad, es necesaria una complementación entre los conocimientos clínicos y moleculares de esta. <br/>El objetivo de esta tesis ha sido la búsqueda de nuevos genes cuya expresión estuviera asociada al fenotipo tumoral de la próstata. Para ello, se ha aplicado la técnica del differential display. A través de esta hemos encontrado dos genes sobreexpresados en cáncer de próstata respecto a la próstata normal, resultado que hemos corroborado mediante RT-PCR semicuantitativa, inmunohistoquímica y Western blot. Uno de ellos, corresponde a un gen de identidad desconocida, al que hemos denominado PTOV1 (Prostate Tumor Overexpressed 1), constituído por un nuevo módulo proteico, repetido en tándem que se encuentra también en otra proteína (PTOV2). PTOV1 se localiza en el cromosoma 19q13 y su expresión está regualada por andrógenos. La localización nuclear de PTOV1, así como su expresión, están relacionadas con el ciclo celular. Mediante la técnica del doble híbrido hemos encontrado varias proteínas que posiblemente interaccionan con PTOV1. <br/>En cuanto al segundo gen, corresponde a EMT (Extraneurona Monoamine Transporter). La expresión de EMT en determinados tumores de próstata es interesante como herramienta terapéutica, desde que se conoce que EMT actúa como transportador del análogo de la cloroetilnitrosourea SarcNU, que es una citotoxina selectiva que se internaliza en la célula específicamente a través de EMT y que actualmente se encuentra en fase clínica 1., Prostate cancer is one of the most common cancer and the second cause of mortality in the male population. In the last few years we have understand the necessity of an interaction between the molecular and clinical research to study this pathology.<br/>Our goal has been the issolation of new genes with an expression associated to the tumoral phenotype of the prostate. To achieve this objective we have use the differential display technic. We have found two genes which are overexpressed in prostate cancer and we have check this result by semiquantitative RT-PCR, inmunohistochemistry and Western blot. One of these genes is a new gene that we have called PTOV1 (Prostate Tumor Overexpressed 1). PTOV1 protein consists in a block (PTOV) tamdenly repeat which is also present in another new protein, PTOV2. PTOV1 is located in the long arm of chromosome 19 (19q13) and his expression is regulated by androgens. The nuclear localization as well as the high levels of expression of PTOV1 are related with cell cycle. To know the function of PTOV1, we have performed the yeast two hybrid system.<br/>The second gene that we have found by differential display is the Extraneuronal Monoamine Transporter (EMT). EMT is a transporter of the cytotoxin SarcNU. The overexpression of EMT in several prostate cancers could provide a new possible antitumoral therapeutic treatment.

Proyecto:

Identificació immunològica i caracterització de les propietats biològiques de la proteïna catiònica d'eosinòfil

  • Carreras Margalef, Ester
La proteïna catiònica d'eosinòfil (ECP) és una ribonucleasa que es troba als grànuls secundaris dels eosinòfils. Els nivells d'ECP en fluids corporals s'utilitza com a indicador del número i activació dels eosinòfils. L'ECP és tòxica per diversos patògens com són bacteris, paràsits, virus i per cèl·lules de mamífer.<br/>Per identificar immunològicament l'ECP s'ha seleccionat una regió específica de la proteïna (D112-P123) com a possible epítop antigènic. La regió D112-P123 no es troba en l'RNasa A, 1, 4 i 5 i és on s'observa una màxima desviació de l'esquelet de la cadena principal de l'ECP i la neurotoxina derivada d'eosinòfil (EDN) amb la qual comparteix un 67% d'identitat de seqüència. S'han immunitzat conills amb un pèptid sintètic (D112-P123) conjugat a una proteïna transportadora i s'han purificat els anticossos policlonals amb una columna d'afinitat amb l'ECP immobilitzada.<br/>L'anticòs D112-P123 reconeix específicament l'ECP en condicions reductores i no reductores i no presenta reactivitat creuada amb l'EDN, l'RNasa A i altres proteïnes control. La immunodetecció per transferència Western amb l'anticòs D112-P123 ha mostrat que hi ha una relació lineal entre la quantitat de proteïna (1-75 ng) i el senyal obtingut. S'ha assajat la reactivitat de l'anticòs D112-P123 en fluids corporals i granulòcits. L'anticòs D112-P123 detecta la forma nadiua no glicosilada i les formes glicosilades de l'ECP en granulòcits, esput i plasma. S'ha obtingut una bona correlació entre els nivells d'ECP determinants amb l'anticòs D112-P123 i amb un anticòs que comercialitza Pharmacia & Upjohn (Uppsala, Suècia).<br/>Per estudiar la relació entre l'estructura i les activitats biològiques de l'ECP s'han obtingut variants de la proteïna en residus específics de l'ECP. S'han escollit residus catiònics i aromàtics exposats en la superfície de la proteïna (W10K, W35A/R36A, R75A/F76A, R101A/R104A) i de la regió del loop D115-Y122 (R121A, R121A/Y122A, (_ 115-122) ECP i (115-122 EDN) ECP . <br/>S'ha estudiat l'efecte de l'ECP i les seves variants en l'activitat ribonucleasa, la disrupció de membranes, la citotoxicitat per bacteris gramnegatius i grampositius i l'inhibició del creixement de cèl·lules de mamífer. També s'ha realitzat una predicció de l'estructura tridimensional dels mutants per modelatge molecular. <br/>Les variants de l'ECP no modifiquen substancialment ni l'estructura tridimensional de la proteïna ni l'activitat ribonucleasa.<br/>L'activitat sobre membranes de l'ECP i les seves variants s'ha analitzat utilitzant vesícules sintètiques. L'ECP mostra una clara preferència per desestabilitzar vesícules acídiques resultat que suggereix que les càrregues positives de la proteïna són importants per la interacció amb les membranes. L'estudi de l'efecte de les mutacions en l'activitat sobre les membranes ha mostrat que aminoàcids catiònics específics i els triptòfans de la proteïna (W10, W35R36 i R101R104) estan relacionats amb la desestabilitazació de la membrana.<br/>Aquests resultats correlacionen bé amb l'efecte dels mutants en la inhibició del creixement de cèl·lules de mamífer. Les regions W35R36 i W10 són essencials per la inhibició de la proliferació. Altres residus catiònics i aromàtics R75F76, R101R104, Y122 tenen un paper secundari en l'inhibició del creixement que es pot explicar per la possible interacció d'aquests residus amb els carbohidrats de la superfície de les cèl·lules de mamífer.<br/>La regió W35R36 té un paper essencial en l'activitat bactericida per grampositius i gramnegatius. Els altres residus estudiats tenen efectes diferents en l'activitat bactericida de l'ECP depenent es tracti d' E. coli o S. aureus. Mentre els residus R101R104 i R75F76 són importants per l'activitat bactericida sobre E. coli, els residus W10 i la regió del bucle D115-Y122 són necessaris per l'activitat bactericida sobre S. aureus. <br/>Podem concloure que les regions catiòniques i hidrofòbiques estudiades participen en la capacitat de l'ECP per desestabilitzar membranes biològiques i/o en la interacció de la proteïna amb components de la paret bacteriana o amb els carbohidrats de la superfície de cèl·lules de mamífer., Eosinophil cationic protein (ECP) is a ribonuclease located in the secondary granules of eosinophils. ECP levels in body fluids are used as an indicator of number and activation of eosionophils. ECP is toxic for many pathogens including bacteria, parasites, virus and for mammalian cells.<br/>To identify ECP we have selected a specific loop region of the protein (D112-P123) as a putative antigenic epitope. This sequence is absent in RNase A, 1, 4 and 5 and the polypeptide main chain adopts a specific conformation in ECP and also in eosinophil-derived neurotoxin (EDN) which shares 67 % sequence homology with ECP. A synthetic peptide containing the sequence and linked to a carrier protein was used to obtain rabbit polyclonal antibodies which were further purified by an affinity column with ECP as a ligand. <br/>D112-P123 antibody specifically recognizes ECP in reducing and nonreducing conditions and does not cross-react with EDN, RNase A or other control proteins. The immunodetection of recombinant ECP by Western blot has shown a lineal relationship between the quantity of protein (1-75 ng) and the signal obtained. The reactivity of the antibody was assayed in different body fluids and granulocytes. D112-P123 antibody detects the glycosylated and nonglycosylated forms of the native ECP in granulocytes, plasma and sputum. A good correlation has been obtained between ECP levels determined by the antibody D112-P123 and by an antibody obtained from a commercial source. <br/>To study the relationship between the structure and biological activities of ECP we have obtained variants of the protein in specific amino acids residues. We have chosen cationic and aromatic amino acids located at the protein surface (W10K, W35A/R36A, R75A/F76A and R101A/R104A) and in the loop region D115-Y122 (R121A, R121A/Y122A, (_ 115-122) ECP and (115-122 EDN) ECP.<br/>For the wild type form and mutants we have determined the ribonuclease and membrane-lytic activity, the cytotoxicity for gram negative and gram positive bacteria and the mammalian cell growth inhibition. The three dimensional structure of ECP mutants has been predicted by molecular modelling.<br/>ECP variants do not show important changes neither on the three dimensional folding nor on the ribonuclease activity of the protein.<br/>The lytic-activity of ECP and mutants on cell membranes has been analysed using synthetic lipid vesicles. ECP shows a notable preference to destabilize acidic liposomes which suggests that the electrostatic interaction between membrane and the protein are important for protein binding. The study of the effect of the mutations in the membrane-lytic activity has shown that specific arginine residues and the two tryptophan residues of the protein (W10, W35R36 and R101R104) are related to the membrane destabilization.<br/>This results correlate well with the effect of the mutants in the mammalian cell growth inhibition. W35R36 and W10 are essentials for the inhibition of proliferation while other cationic and aromatic residues, R75F76, R101R104 and Y122, play a secondary role which might be explained for the possible interactions of these residues with the carbohydrates on the surface of mammalian cells.<br/>W35R36 are essentials for the bactericidal activity for gram positive and negative bacteria. Other amino acid residues have different effects depending on the bacterial strain E. coli or S. aureus. While R101R104 and R75F76 are necessary for the bactericidal activity for E. coli the W10 residue and the loop region D115-Y122 are necessaries for the cytotoxic activity for S. aureus.<br/>We can conclude from the studied ECP mutants that specific cationic and hydrophobic residues studied participate on the ability of the protein to destabilize biological membranes and/or in the interaction of the protein with components of the bacterial cell wall or the surface of mammalian cells.

Proyecto:

Estudio de la expresión de la formaldehído deshidrogenasa dependiente de glutatión de arabidopsis thaliana y su función en la patogénesis

  • Díaz Solares, Maykelis
La formaldehído deshidrogenasa dependiente de glutatión (FALDH) (EC 1.2.1.1), conocida también como ADH clase III, es un enzima ubícuo, presente en el reino vegetal y animal. La eliminación del formaldehído dentro de la célula se realiza principalmente mediante la FALDH, que utiliza NAD+ como cofactor. El formaldehído es un intermediario del metabolismo celular normal, aunque puede tener también un origen exógeno, siendo un polucionante atmosférico y de aguas residuales. Por otra parte, el formaldehído se forma intracelularmente durante la peroxidación lipídica en situaciones de estrés oxidativo. La eliminación de este formaldehído, que es muy tóxico para la célula, es necesaria para su supervivencia.<br/>Recientemente se ha descubierto que la FALDH tiene también actividad S-nitrosoglutatión reductasa. El S-nitrosoglutatión (GSNO) es uno de los más abundantes metabolitos endógenos del oxido nítrico (NO), que actúa como uno de los señalizadores moleculares en los mecanismos de defensa de las plantas.<br/>En esta Tesis Doctoral hemos demostrado que la expresión de la FALDH está regulada por herida y por diferentes hormonas vegetales, tales como el ácido jasmónico y el ácido salicílico. También hemos generado plantas transgénicas de A. thaliana portadoras de una construcción antisentido, que presenta una importante disminución de la actividad enzimática FALDH, directamente relacionados con los niveles de proteína. Dichas plantas transgénicas tienen una menor capacidad de metabolizar formaldehído exógeno y presentan un aumento de la resistencia basal a patógenos fúngicos y bacterianos. Por otra parte, las plantas transgénicas con niveles de FALDH modificados (tanto las antisentido como las de sobreexpresión) muestran un fenotipo diferente, principalmente en la raíz. La inmunolocalización en tejidos reveló que la FALDH presenta un patrón de expresión en hojas y en raíz que es específico del tipo celular. A nivel subcelular, la FALDH está presente en citoplasma, núcleo y cloroplasto. Esta es la primera vez que se describe la localización cloroplástica de la FALDH., The glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase (FALDH) is the main enzyme of the formaldehyde detoxification system in eukaryotes. In Arabidopsis, it is coded by a single gene, which is constitutively expressed. To gain more insight into the functional role of this enzyme in plants, we have studied the spatial distribution of the enzyme at cellular and subcellular level. By immunolocalization experiments on root and leaf sections we have demonstrate that the pattern of expression of the enzyme is cell specific. At subcellular level, FALDH localizes in cytoplasm, nucleus and chloroplasts. We have demonstrated that Arabidopsis plants with reduced levels of FALDH, bearing antisense constructs, show a slower rate in formaldehyde elimination. These results confirm the central role of FALDH in formaldehyde metabolism in plants and have important implications in the phytoremediation of environmental formaldehyde. We observed also that the antisense transgenics lines were more resistance to the infection with pathogens (bacteria and fungus).<br/>The importance of FALDH has been greatly increased by the discovery of its potent activity toward S-nitrosoglutathione, the condensation product of glutathione and nitric oxide (NO). NO and NO-related metabolites, such as S-nitrosothiols (SNOs) play a central role in signal transduction and host defense. We have investigated the gene response to mechanical wounding and plant hormones involved in signal transduction, showing that the gene is down-regulated by wounding in a JA-dependent pathway, and that it is transcriptionally activated by salicylic acid. This is the first time that regulation of FALDH in response to signals associated with plant defense has been demonstrated.

Proyecto:

Classification of loops in protein structures: applications on loop modeling and protein function

  • Fernández Fuentes, Narcís
Aquesta tesis esta estructurada en cinc capítols. Al capítol I, es fa una introducció als llaços, el subjecte d'estudi d'aquesta tesis. A més, es fa una petita introducció a les bases de dades biològiques de us corrent i de protocols bio-informàtics en comparacions de seqüències. Del capítol II al IV s'explora el paper que els llaços juguen a les proteïnes utilitzant un enfocament bio-informàtic, es realitza una classificació estructural de llaços (capítol II); es realitza un estudi per inferir relacions d'estructura i funció (capítol III) i es realitza un estudi de predicció d'estructura de llaços (capítol IV). Finalment al capítol V es presenten unes consideracions finals al treball realitzat i es proposen futures extensions al mateix.<br/>El treball realitza per el Dr. Oliva ha sigut el punt d'inici d'aquesta tesis. Al capítol II es presenta un procés totalment automatitzat de classificació estructural de llaços de proteïnes quinases. Diferent millores varen ser introduïdes al treball original del Dr. Oliva: (i) un nou procés de reagrupació que evita els solapament entre agrupacions de llaços, (ii) un servidor web que permet l'accés i recerca de dades sobre els llaços classificats a través de internet, (iii) referències creuades amb altre bases de dades important. El capítol III es centra en dues qüestions bàsiques: la conservació de la estructura dels llaços i la seva funció i la conservació de la estructura dels llaços i la seva relació amb l'evolució. Un extensiu estudi sobre una classificació estructural de llaços de proteïnes quinases va ser realitzat. El motiu pe el quan les quinases varen ser escollides com a subjecte d'estudi es degut a la seva importància biològica i perquè hi ha molta informació disponible a la literatura. Finalment al capítol IV s'estudia la aplicabilitat de les classificacions estructurals de llaços en el camp de la predicció d'estructura. Es va realitzat un test de validació (Jack-knife test) per provar la utilitat de la informació de la seqüència en forma de perfils de les agrupacions estructurals de llaços., This thesis is structured into five chapters. In chapter I, protein loops - the topics of this thesis work - are introduced. Also, a short description of biological databases and current protocols in sequence comparison are given. Chapters II to IV explore a major role that loop segments play in protein structures by using a structural bio-informatics approach: (i) the structural classification (ii) the relationship between the structure and function and (iii) the structure prediction of loops. The conclusive chapter V is devoted to several considerations that complement the conclusions given in previous chapters. Extensions of this thesis work are also suggested.<br/>The research project on structural classification of loops, which was carried out by Dr. Oliva (Oliva et al. 1997), has been the starting point for all the other subsequent projects. In chapter II, a fully automated process for the structural classification of loops of kinases is presented. Several methodological improvements were made on the basis of Oliva's original work: (i) a newly introduced re-clustering process allows to avoid overlaps in classified loop clusters, (ii) a new web server was established to provide access and/or to query data through the internet, and (iii) cross referencing links were introduced with other biological databases. Chapter III focuses on two questions: the conservation of loop structures and functions and the extent of conservation of loop structures during evolution. An extensive analysis of a structural loop database of protein kinases was carried out. There are two main reasons why kinases were selected for the subject of this study: first, their critical biological relevance, and second the vast amount of functional information available in the literature and biological databases. Finally, in chapter IV, we apply ArchDB(Espadaler et al. 2004) for loop structure prediction. A Jack-knife test is performed to assess the usefulness of sequence information, which is included in the form of profiles in our structural clusters.

Proyecto:

Paper dels lípids de membrana en la capacitació i reacció acrosòmica de l'espermatozoide de boc: estudis biofísics

  • Companyó Casanovas, Mònica
La sortida de colesterol juga un paper important en la capacitació i reacció acrosòmica de l'espermatozoide. En aquesta tesi s'ha establert l'efecte de la sortida de colesterol en la "fluïdesa" de la membrana plasmàtica i en la reacció acrosòmica (RA) de l'espermatozoide de boc. <br/>La incubació dels espermatozoides en b-ciclodextrina (bCD) 8 mM com a acceptor de colesterol va donar lloc a una sortida de gairebé un 50% del colesterol de les membranes i la RA va ser induïda fins a un 35%. No obstant, quan només era eliminat el 30% de colesterol de les membranes, no s'induïa RA. Aquesta sortida de colesterol no anava acompanyada de sortida de fosfolípids, indicant que s'havia preservat la integritat de les membranes. L'esmentada sortida és molt ràpida, segueix una cinètica exponencial decreixent amb una semivida d'aproximadament 10 min, arribant al nivell asimptòtic al cap d'uns 30 min. Aquesta cinètica contrasta amb la cinètica lenta de la RA; es necessiten gairebé 2 h per assolir el màxim percentatge de RA. Es conclou que la sortida de colesterol, per sí sola, indueix RA.<br/>Es va investigar l'efecte de la sortida de colesterol en la "fluïdesa" de membrana d'espermatozoides vius i en liposomes procedents d'extractes lipídics d'espermatozoides. Utilitzant l'anisotropia de fluorescència del 1,6-difenil-1,3,5-hexatriè (DPH) es va estudiar el comportament termotròpic dels lípids de membrana, després d'1 h d'incubació dels espermatozoides en presència o absència de bCD 8 mM. Les dades experimentals es van ajustar a corbes teòriques sigmoidals, la qual cosa ens va permetre determinar acuradament els paràmetres del comportament termotròpic. En el cas dels espermatozoides sencers, es van distingir dues transicions de fase diferents, atribuïbles a diferents dominis lipídics. Així doncs, a les membranes dels espermatozoides coexisteixen regions fluïdes amb regions clarament més rígides. La sortida de colesterol va donar lloc a importants canvis en l'extensió relativa de les dues transicions de fase, indicant un increment de la fluïdesa d'alguns microdominis lipídics de la membrana dels espermatozoides i una reorganització lateral dels dominis lipídics, just abans de l'inici de la RA. <br/>Per tal d'establir quins dels macrodominis de la membrana plasmàtica de l'espermatozoide estaven implicats en la sortida de colesterol, es va utilitzar la microscòpia confocal. Mitjançant merocianina 540 com a marcador de fluïdesa, es van determinar quatre patrons de marcatge diferents en la membrana de l'espermatozoide de boc. Aquests quatre patrons tenien en comú un intens marcatge de la peça intermèdia, i es diferenciaven pel seu marcatge en el cap. Els tres patrons majoritaris es caracteritzaven per presentar o bé un marcatge en tot l'acrosoma, o bé un marcatge limitat al segment equatorial, o be un marcatge tant en el segment equatorial com en el segment apical. El patró minoritari es caracteritzava per tenir el postacrosoma més marcat. La sortida de colesterol va fer variar la freqüència d'aquests quatre patrons: va augmentar la freqüència dels patrons que presentaven un marcatge en el segment equatorial i en el segment equatorial i apical. Així doncs, la sortida de colesterol va fer augmentar la fluïdesa de la membrana plasmàtica dels espermatozoides de boc en uns macrodominis ben definits, el segment equatorial i el segment apical. La fluïdesa de la regió postacrosomal va romandre inalterada.<br/>Per tal de poder quantificar, a nivell poblacional, els canvis de fluïdesa de membrana dels espermatozoides durant la capacitació, es va utilitzar la citometria de flux. Amb aquesta tècnica es va atribuir al conjunt de la població d'espermatozoides vius un augment de la fluïdesa de membrana, induïda per la incubació en bCD 8 mM durant 1 h. Aquesta fluïdesa es va veure incrementada encara, al cap de 2 h, coincidint amb la RA massiva., Cholesterol efflux plays an important role in sperm capacitacion and membrane fusion in the acrosome reaction (AR). In this thesis, we established the effect of cholesterol removal from goat spermatozoa on membrane "fluidity" and acrosomal responsiveness. <br/>Mature goat spermatozoa were incubated in BSA-free medium in the presence of b-cyclodextrine (bCD) as cholesterol acceptor. After incubation with 8 mM bCD, approximately 50% of cholesterol was released from sperm membranes with no loss in the phospholipid content, indicating membrane preservation, and 35% of AR was induced. However, when only 30% of cholesterol was lost, this moderate cholesterol decrease was unable to initiate AR. Cholesterol desorption was very rapid, following an exponential decay with a half-time of around 10 min, and reaching an asymptotic level at 30 min. This kinetics is in contrast with the slow sigmoidal kinetics of acrosomal responsiveness: around 2 h were required for maximal AR. Our results suggest that cholesterol efflux has a direct influence on the onset of the AR, that is, merely removing cholesterol would trigger the AR. <br/>We also investigated the effect of cholesterol removal from mature goat spermatozoa on membrane "fluidity" of live cell membranes and liposomes from sperm lipid extracts. Using steady state fluorescence anisotropy of 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH), we studied the thermotropic behavior of the membrane lipids, after incubation of live sperm for 1 h in BSA-free medium with the presence/absence of 8 mM bCD, as a cholesterol acceptor. Unimodal and bimodal theoretical sigmoids fitted best to the experimental thermotropic profiles of liposomes and whole cells, respectively. In the case of whole sperm, two transitions, attributable to different lipid domains, were clearly separated by using the fitting parameters. So, in sperm membranes fluid domains and rigid domains co-exist. After cholesterol removal, important changes in the relative extension of the two transitions were found, indicating an increase of the "fluidity" of some of the lipid microdomains of sperm membranes and a rearrangement in the lateral domain organization, just before the onset of AR.<br/>In order to establish which domains of sperm plasma membrane were implicated in cholesterol loss, we used confocal microscopy. Using merocyanine 540 as a fluidity probe, we found four staining patterns in goat sperm plasma membrane. These patterns were characterized by a strong labelling of the midpiece, and differed by their head labelling. The three most frequent patterns presented a strong labellig in all the acrosome (pattern A) or in only the equatorial region (pattern B) or in the equatorial and apical regions (pattern C). In the less frequent pattern (pattern D) the more intensely labelled region was the postacrosome. Cholesterol efflux modified the frequencies of these four patterns: an increase in the frequencies of patterns B and C at expense of patterns A and D. So, cholesterol desorption increased the fluidity of goat sperm plasma membrane in well defined macrodomains, the equatorial and apical regions. The fluidity of the postacrosomal region remained unchanged.<br/>In order to study the distribution of membrane fluidity in a goat sperm population during capacitation, we used flow cytometry. Using this technique the increase in membrane fluidity induced by 1 h of incubation on 8 mM bCD was attributed to the live sperm population. This fluidity was still increased after 2 h of incubation, just when the AR maximum percentage was reached.

Proyecto:

Modelització de receptors acoblats a proteïna G: disseny d'agonistes i antagonistes

  • Olivella i Garcia, Mireia
Els receptors acoblats a proteïna G són una família de proteïnes de membrana que està implicada en moltes malalties d'una gran importancia en la nostra societat actual. Degut a la manca d'estructures tridimensionals d'aquests receptors s'ha desenvolupat un protocol per tal d'estudiar-los in silico. Aquest protocol utilitza les simulacions de dinàmica molecular per a estudiar l'estructura i la funció dels GPCRs tot tenint en compte l'entorn hidrofòbic de la bicapa lipídica en el que es troben i l'efecte dels residus de serina i treonina en la conformació de les hèlixs alfa d'aquests receptors. A partir del protocol s'ha construit i validat a través del disseny racional de fàrmacs un model tridimensional per receptor 5-HT1A que a més a més és vàlid per a la majoria dels receptors de les amines biogèniques. Aquest model s'ha utilitzat per a identificar el mode d'unió dels receptors serotoninèrgics amb els seus lligands. La modelitzaió del mode d'unió dels receptors amb els seus lligans ha permès el disseny de nous lligands amb més afinitat i selectivitat. Tot el treball computacional s'ha validat a través de la síntesi i avaluació farmacològica dels lligands així com amb experiments de mutagènesi dirigida., G-protein coupled receptors (GPCRs) are membrane proteins that transduce and amplify extracellular chemical signals to the interior of the cell. Due to its prominent role in cell signalling, GPCR malfunction is involved in a wide variety of diseases. Because of the lack of X-ray resolved GPCR structures, this thesis presents a protocol to study the structure and function of these proteins in silico. This protocol is based on molecular dynamics simulations, and takes into account explicitly the hydrophobic environment of the receptors due to the surrounding cellular membrane. In addition, it considers the influence of serine and threonine residues in the global conformation of the hydrophobic transmembrane alpha-helices that constitute the structural feature common to all GPCRs. Based on this protocol, a three dimensional model for 5-HT1A receptor has been constructed, which is valid for most of the biogenic amine receptor family. The computational models of the binding site of serotoninergic receptors have been validated through the synthesis and pharmacological evaluation of new ligands, and through site-directed mutagenesis experiments. This way, these three-dimensional models have allowed to identify and characterize the binding site of the serotoninergic receptors 5-HT1A, 5-HT4 and 5-HT7, and to design new ligands with improved affinity and selectivity for these receptors.

Proyecto:

Estudi estructural i cinètic de l'especificitat de coenzim d'una alcohol deshidrogenasa d'amfibi dependent de Nadp(h)

  • Rosell Febres, Albert
Els teixits gàstrics de l'amfibi Rana perezi expressen una alcohol deshidrogenasa (ADH8) dependent de NADP(H), una especificitat de coenzim única dintre de les ADHs de vertebrat. Aquest enzim és actiu amb etanol i retinoides. Han estat resoltes i refinades les estructures tridimensionals de l'ADH8 i del complex binari ADH8-NADP+ a 2,2 i 1,8 Å, respectivament. ADH8 presenta una identitat de seqüència amb ADHs dependents de NAD(H) de vertebrat inferior al 60%. La seva especificitat de coenzim i de substrat suggereixen un paper d'aquest enzim en la reducció d'aldehids més que en l'oxidació d'alcohols. El gran volum del seti d'unió al substrat pot explicar les altes eficiències catalítiques d'ADH8 amb retinoides. La preferència per el NADP(H) sembla ser deguda a la presència en ADH8 de la triada Gly223-Thr224-His225, i al manteniment dels residus conservats Lys228 i Leu200, que defineixen un seti d'unió per el grup fosfat terminal del cofactor. El NADP(H) s'uneix a l'ADH8 amb una conformació extesa. Aquest coenzim es pot superposar amb el NAD(H) unit en complexos d'ADHs dependents de NAD(H). Les desviacions conformacionals més grans corresponen al grup adenina-ribosa de la molècula. No s'observaren diferències adicionals en el seti d'unió al dinucleòtid, fet que explicaria que el NAD(H) pugui també ser utilitzat com a cofactor per ADH8.<br/>En el complex crystal.logràfic ADH8-NADP+, el seti d'unió del grup fosfat extra del coenzim està format per Gly223-Thr224-His225, residus específics de l'ADH8, i per les posicions conservades Leu200 i Lys228. Amb l'objectiu d'investigar els mínims determinants estructurals responsables de l'especificitat de coenzim, diferents mutants d'ADH8 en les posicions 223-225 foren dissenyats i cinèticament caracteritzats. El mutant G223D, tot i presentar una càrrega negativa en el seti d'unió al fosfat, encara preferia el NADP(H) com a coenzim, de la mateixa manera que els mutants T224I i H225N. Les eficiències catalítiques amb NADP(H) disminuiren dramàticament en els dobles mutants, G223D/T224I i T224I/H225N, i en el triple mutant G223D/T224I/H225N (kcat/KmNADPH = 760 mM-1min-1), respecte l'enzim silvestre (kcat/KmNADPH = 133330 mM-1min-1). Aquest resultat fou associat amb una més baixa afinitat per el NADP+ i amb un canvi en l'etapa limitant de la reacció. Contràriament, en el triple mutant, l'eficiència catalítica amb NAD(H) incrementà, assolint valors (kcat/KmNADH = 155000 mM-1min-1) similars als de l'enzim silvestre amb NADP(H). La reversió completa de l'especificitat de coenzim de l'ADH8 doncs, fou aconseguida amb únicament la substitució de tres residus consecutius en el seti d'unió del fosfat extra, un resultat sense precedents dintre de la família ADH., Gastric tissues from amphibian Rana perezi express an alcohol dehydrogenase (ADH8) with a distinct specificity for NADP(H) and active with ethanol and retinoids.The three-dimensional structures of ADH8 and of the binary complex ADH8-NADP+ have been determined and refined to resolutions of 2.2 and 1.8 Å, respectively. ADH8 exhibits less than 60% sequence identity with vertebrate NAD(H)-dependent ADHs. Its coenzyme and substrate specificity support a role in aldehyde reduction rather than in alcohol oxidation. The large volume of the substrate-binding pocket can explain the high catalytic efficiency of ADH8 with retinoids. Preference for NADP(H) appears to be achieved by the presence in ADH8 of the triad Gly223-Thr224-His225, and the recruitment of conserved Lys228 and Leu200, which define a binding pocket for the terminal phosphate group of the cofactor. NADP(H) binds ADH8 in an extended conformation and can be superimposed with NAD(H) in NAD(H)-dependent ADH complexes, the largest conformational deviations being for the adenine-ribose moiety of molecule. No additional reshaping of the dinucleotide binding site is observed which explains why NAD(H) can also be used as a cofactor by ADH8.<br/>In the crystallographic ADH8-NADP+ complex, a binding pocket for the extra phosphate group of coenzyme is formed by ADH8-specific residues Gly223-Thr224-His225, and the highly conserved Leu200 and Lys228. In order to investigate the minimal structural determinants for coenzyme specificity, several ADH8 mutants involving residues 223 to 225 were engineered and kinetically characterized. The G223D mutant, having a negative charge in the phosphate-binding site, still preferred NADP(H) over NAD(H), as did the T224I and H225N mutants. Catalytic efficiency with NADP(H) dropped dramatically in the double mutants, G223D/T224I and T224I/H225N, and in the triple mutant, G223D/T224I/H225N (kcat/KmNADPH = 760 mM-1min-1), as compared to the wild-type enzyme (kcat/KmNADPH = 133330 mM-1min-1). This was associated with a lower affinity for NADP+ and a change in the rate-limiting step. Conversely, in the triple mutant, catalytic efficiency with NAD(H) increased, reaching values (kcat/KmNADH = 155000 mM-1min-1) similar to those of the wild-type enzyme with NADP(H). The complete reversal of ADH8 coenzyme specificity was therefore attained by the substitution of only three consecutive residues in the phosphate-binding site, an unprecedented achievement within the ADH family.

Proyecto:

Elementos estructurales de la cromatina en los cromosomas mitóticos

  • Caravaca Guasch, Juan Manuel
Nuestro grupo ha estudiado la estructura de la cromatina de núcleos de eritrocitos de pollo (Bartolomé et al., 1994; Bartolomé et al., 1995; Bermúdez et al., 1998). La consecuencia de estos estudios ha sido la elaboración de un modelo para el plegamiento de la fibra de cromatina con una elevada concentración local del DNA (Daban y Bermúdez, 1998; Daban, 2000). Sin embargo, el nivel máximo de condensación en la cromatina, se encuentra en el interior de los cromosomas metafásicos. Aunque la bibliografía ha planteado diferentes modelos para el plegamiento de la cromatina en el interior de éstos, existe un conocimiento muy escaso acerca de la estructura molecular de la cromatina en los cromosomas condensados.<br/>Se ha realizado un estudio exhaustivo de microscopía electrónica de transmisión sobre la estructura de los cromosomas metafásicos de células HeLa. Se han estudiado un total de 4410 micrografías de cromosomas metafásicos, que en su mayor parte han sido tratados con diversos medios parcialmente desnaturalizantes, para poder analizar su estructura interna.<br/>Morfológicamente, los cromosomas estudiados en este trabajo pueden agruparse en tres tipos diferentes: compactos, granulados y fibrilados. La morfología más abundante es la compacta y se observa en presencia de cationes monovalentes y divalentes a concentración similar a la presente en la cromatina metafásica (Mg2+ 1.7-40 mM). Estos cromosomas tienen las cromátidas muy densas y en sus bordes se aprecian una serie de estructuras planas superpuestas. En condiciones de menor concentración de cationes (Mg2+£ 1.7 mM), la morfología dominante es la granular. Estos cromosomas están compuestos principalmente por gran cantidad de cuerpos circulares de 30-40 nm de diámetro. Únicamente en condiciones de fuerza iónica extremadamente baja podemos encontrar la morfología fibrilar, la cual se caracteriza por la abundancia de fibras de 30-40 nm.<br/>Los resultados obtenidos con cromosomas parcialmente desnaturalizados nos permiten concluir que existen tres elementos estructurales en el interior de los cromosomas metafásicos: la fibra, el gránulo y la placa.<br/>Las fibras gruesas con diámetros que oscilan entre los 100 y los 500 nm son el resultado de la deformación plástica de las cromátidas durante los diferentes procesos de preparación de las muestras. En función de las condiciones iónicas del medio las fibras gruesas muestran gránulos o placas en su interior. Las fibras delgadas están formadas por una sucesión de cuerpos de 30-40 nm de diámetro unidos irregularmente mediante interacciones cabeza-cola. Las fibras delgadas se observan dominantemente en condiciones de concentración salina extremadamente baja.<br/>Los gránulos son unos cuerpos circulares compactos de unos 30-40 nm de diámetro. Estos cuerpos compactos descritos previamente por nuestro grupo y se interpretaron como una forma de plegamiento solenoidal de la fibra de 30 nm (Daban y Bermúdez, 1998). Se encuentran presentes en todas las condiciones estudiadas en este trabajo, siendo especialmente abundantes en presencia de iones divalentes a concentración baja y en muestras tratadas con nucleasa micrococal. <br/>La placa es un elemento estructural característico de los cromosomas cuando éstos se encuentran en su forma más compacta, en presencia de concentraciones elevadas de cationes divalentes. Esta estructura no había sido descrita previamente por otros laboratorios. Es una estructura cromatínica de gran regularidad y con una superficie muy lisa. Hemos estimado la altura de estas placas a través de muestras sombreadas unidireccionalemente con platino. El promedio de los valores obtenidos es de 6.7 ± 1.4 nm.<br/>En conjunto los resultados obtenidos en esta tesis permiten sugerir que el componente principal de la cromatina en los cromosomas metafásicos es el gránulo de 30-40 nm. Dependiendo de las condiciones iónicas, este elemento estructural fundamental se agrega a través de uniones cabeza-cola para formar fibras (fuerza iónica muy baja), o bien se agrega mediante interacciones laterales para formar placas (condiciones salinas próximas a las de la cromatina metafásica)., Our group has studied the chromatin structure in the chicken erythrocyte nuclei (Bartolome et al., 1994; Bartolomé et al., 1995; Bermúdez et al., 1998). The consequences of this studies has been the elaboration of a folding model of the chromatin fiber with a high local concentration of DNA. However, the maximum level of chromatin condensation, is found in the metaphase chromosomes. Although the bibliography has proposed different models to explain the chromatin folding inside the chromosomes, there is a low knowledge about the molecular structure of chromatin in the condensed chromosomes. <br/>In this thesis, we have carried out an exhaustive electron microscopy study about the HeLa cells metaphase chromosomes. We have studied a large number of chromosome electron micrographs (4410). Chromosomes were partially denaturated under a wide variety of conditions in order to observe some chromatin structural element inside them.<br/>Our studies indicate that chromosomes can adopt three global structural forms in function of the ionic conditions: compact, granular and fibrillar.<br/>The compact form is the most frequent and we can observe it in the presence of monovalent and divalent cations in similar concentrations than the ones found in metaphase chromatin (Mg2+ 1.7-40 mM). These chromosomes have highly condensed chromatids and we can appreciate overlapped chromatin plates around the chromosomes edges. When the chromosomes are incubated with solutions containing lower cations concentration (Mg 2+£ 1.7 mM) they become granular. The granular structures seen inside these chromosomes show a diameter of about 35 nm. Fibrillar chromosomes are observed only at very low ionic strength. The fibers seen emanating from the chromatids have a diameter of 30-40 nm.<br/>Our results obtained from partially denaturated chromosomes show that there are three structural elements inside the metaphase chromosomes: the fiber, the 30-40 nm chromatin granule and the plate.<br/>The largest fibers with a diameter of 100-400 nm, presumably are produced by mechanical deformation of chromosomes during the preparation processes. Depending of the ionic conditions these fibrillar structures are composed by plates or granules. The thinnest fibers are formed by face to face association of the 30-40 nm chromatin granules. These kind of fibers are usually found only at very low ionic strength.<br/>The chromatin granules are compact bodies with 35 nm of diameter. These compact bodies were previously described in our laboratory and were modeled as compact solenoids of nucleosomes forming (Daban and Bermúdez, 1998). They are usually seen at low divalent cation concentrations and in chromosome samples treated with micrococal nuclease.<br/>The plate is the most frequent structural element when the chromosomes are in their compact form (high ionic strength, similar to physiological conditions). This element has not been described by any group. It is a chromatin element with a regular structure and very smooth surface. We have estimated the height of the steps between layers in unidirectional shadowing experiments. The value obtained is 6.7 ± 1.4 nm.<br/>Our results suggest that the fundamental component inside the metaphase is the 30-40 nm chromatin granules. Depending of the ionic conditions, this basic structural element forms fibers through face to face interactions (very low ionic strength) or form plates through side to side interactions (high ionic strength similar to metaphase chromatin).

Proyecto:

Caracterización y expresión de mutaciones en genes específicos de retina asociados a retinosis pigmentària autosómica dominante (RPAD)

  • Martínez Gimeno, Maria
La retinosis pigmentària (RP) es una enfermedad hereditaria que provoca una degeneración progresiva de la retina y en la mayoría de los casos conduce a la ceguera.<br/>El trabajo realizado ha permitido clasificar genéticamente a los pacientes afectados de RP, atendiendo a su patrón de herencia.<br/>Uno de los objetivos ha sido la determinación del origen molecular de la RP en los casos de retinosis pigmentaria autosómico dominante (RPAD) en la población española así como en casos esporádicos o aislados de RP (SRP). Así, se ha realizado el estudio genético directo de los genes de expresión específica de retina asociados a retinosis pigmentària autosómica dominante (RHO, RDS-periferina, ROM-1, RP1, NRL y CRX) y la caracterización de las mutaciones detectadas. Se recogen también la expresión clínica de las mutaciones descritas y, en los casos que ha sido posible, se ha procurado establecer una co-relación genotipo-fenotipo.<br/>Así mismo, se han clonado los genes NRL y CRX, factores de transcripción de genes específicos de retina asociados a RPAD. A partir del gen NRL clonado y, mediante mutagénesis dirigida por PCR, se han obtenido in vitro dos mutantes del gen NRL detectados en la población estudiada. Estudios in vitro de expresión génica con estos mutantes muestran una regulación diferencial del promotor del gen de la rodopsina con respecto la proteína salvaje, produciendo una sobre expresión del gen regulado. Se postula que una sobre alteración de la dosis génica puede ser un mecanismo patológico que desencadene la enfermedad., The retinosis pigmentària (RP) is a hereditary disease that provokes a progressive degeneracy of the retina and in the majority of the cases he(she) drives to the blindness.<br/>The realized work has allowed to classify genetically the affected patients of RP, attending to his(her,your) boss of inheritance(heredity).<br/>One of the aims(lenses) has been the determination of the molecular origin of the RP in the cases of retinosis pigmentaria autosómico dominant (RPAD) in the Spanish population as well as in cases sporadic or isolated of RP (SRP). This way, there has been realized the genetic direct study of the genes of specific expression of retina associated to retinosis pigmentària autosómica dominant (RHO, RDS-periferina, ROM-1, RP1, NRL and CRX) and the characterization of detected mutations.<br/>There is gathered also the clinical expression of the described mutations and, in the cases that it(he,she) has been possible, a co-relation has tried(got) to establish genotype - fenotipo.<br/>Likewise, there are clonado the genes NRL and CRX, factors of transcription of specific genes of retina associated with RPAD. From the gene NRL clonado and, by means of mutagénesis directed by PCR, there have been obtained in vitro two mutants of the gene NRL detected in the studied population. In vitro studies of gene expression with these mutants show a differential regulation of the promoter of the gene of the rodopsina with respect the wild protein, producing one on expression of the regular gene. There is postulated that one on alteration of the dose génica can be a pathological mechanism that unleashes the disease.

Proyecto:

Buscador avanzado