Buscador

Encontrado(s) 2218977 resultado(s)
Encontrada(s) 221898 página(s)

Anàlisi dels Fluxos de Materials de Sistemes. Avaluació del Metabolisme Material a Diferents Escales

  • Sendra Sala, Cristina
L'anàlisi de les dimensions d'un sistema social o econòmic ja sigui un país, un sector productiu o una empresa, generalment es mesura en unitats monetàries. Com a molt, la sortida dels sistemes productius es quantifica en unitats físiques, ja que aquests són els valors o indicadors que tradicionalment s'han considerat rellevants i útils per a la presa de decisions. <br/>La incorporació de criteris ambientals en la presa de decisions és una necessitat marcada pels límits del nostre planeta. Límits condicionats tant per la capacitat finita de subministrament de recursos, com d'assimilació o regeneració dels fluxos emesos com a conseqüència de les activitats antropogèniques. <br/>Per poder incorporar aquesta perspectiva ambiental a l'anàlisi dels sistemes, una alternativa és combinar l'anàlisi crematístic tradicional dels sistemes econòmics i productius, amb una anàlisi física. Aquesta anàlisi física ha de permetre quantificar l'entrada de material necessari per generar cada unitat de sortida, tant si tenen valor econòmic com si no, ja que en qualsevol cas, tenen o poden tenir un valor ambiental. <br/>En aquest context s'han quantificat les necessitats i el consum de materials de Catalunya entre els anys 1990 i 2004 (capítol 4). Els resultats mostren un clar augment de l'ús de materials en el període analitzat, tant en termes absoluts com per unitat de PIB generat o per capita. Els resultats mostren la forta dependència que Catalunya té de l'exterior per mantenir el ritme de creixement segons el model actual i la gran influència del sector de la construcció en el metabolisme material de tot el país.<br/>Per poder determinar, a una escala més reduïda i en més detall, els impactes ambientals associats a les principals fonts de consum de Catalunya, s'ha avaluat el metabolisme del sector de la construcció a Catalunya per l'any 2001 (capítol 5), i s'ha proposat un mètode per a quantificar el metabolisme de les àrees industrials i empreses (capítol 6). Els resultats mostren l'eficiència en l'ús de materials però a aquesta escala es combinen els indicadors de materials amb les necessitats energètiques i el consum d'aigua dels diferents sistemes. <br/>Els resultats de l'anàlisi del metabolisme del sector de la construcció (capítol 5) posen en rellevància que el principal problema del sector és l'elevat volum de recursos utilitzats. Aquest gran consum té unes fortes implicacions en l'augment de l'estoc de materials artificialitzats dins del territori català any rere any, però també en unes elevades necessitats energètiques pel transport i processament dels productes utilitzats. Els resultats mostren que la millora en l'eficiència dels processos productius és una mesura insuficient i, que cal combinar-la amb una intervenció que limiti la construcció, si es vol tendir cap a una desmaterialització del país. També mostra la necessitat d'utilitzar l'estoc material present en les construccions existents, com a via per a disminuir la dependència de l'entorn natural propi i extern.<br/>Per acabar de completar l'anàlisi del metabolisme del país i les vies de millora en el sector industrial, s'analitza el metabolisme d'una àrea industrial (capítol 6). A través d'un cas d'estudi d'una àrea situada a Santa Perpètua de Mogoda, es proposa una metodologia per quantificar el metabolisme d'àrees industrials. La metodologia és anàloga i comparable a la utilitzada per a tot Catalunya i pel sector de la construcció, i es centra en avaluar els punts dèbils del sistema i quantificar millores a través de la simbiosi industrial entre empreses.<br/>De totes les anàlisis realitzades se'n desprenen uns indicadors que, si bé sols no són suficients, combinats amb d'altres eines poden ajudar a quantificar les conseqüències dels nivells d'ús de recursos naturals, posar límits, detectar les oportunitats i els punts dèbils del model econòmic de Catalunya., The Earth' limits require the incorporation of environmental criteria in the decision making. Limits are determined by the restrictions in resources availability and the regenerative capacity of the planet to assimilate the anthropogenic activity. More wide spread analysis to evaluate the dimensions and viability of a socio economic systems, has been done in monetary units, although it is unable to incorporate the limits of the Planet.<br/>In order to include the environmental criteria, the monetary analysis should be combined with other tools such as the analysis of the physical dimensions of a socio economic system. This physical quantification allows measuring the material input required per output produced, including its value as a physical resource independently of its monetary value.<br/>In this thesis, the material requirement and consumption of Catalunya has been accounted, between 1990 and 2004 (chapter 4). The results show the materialisation of the region in the period analysed, in absolute terms, per GDP and per capita. Catalunya also has a strong dependence on foreign trade to sustain its growth rate and its economic model. The results also confirm the huge influence of the construction sector in the overall metabolism of the region.<br/>In order to measure the environmental impacts at a lower level, with more detail, the metabolism of the construction sector, in 2001, has been accounted for (Chapter 5). As well as a method for the quantification for companies and industrial area's metabolism has been proposed (Chapter 6). The results show the efficiency in materials use but, at this level, the derived material indicators are combined with indicators of water and energy requirement.<br/>The analysis of the metabolism of construction sector illustrates that the main problem with this sector is the high volume of material used. The high consumption of resources in construction is directly related to the increase of material stock in Catalonia every year but, it also has a strong influence on the freight transport requirements and on the energy profile of the region. The results point out that an improvement in the efficiency in material's manufacturing is not enough for the region's dematerialisation. The increase in efficiency should be combined with the limitation of constructions activities, efforts in design to dematerialize constructions and the necessity to use the existing stock as a future material source.<br/>To complete the analysis of the metabolism of the region and the means to improve industrial sector the metabolism of an industrial area has been analysed (Chapter 6). Through a case study of an area located in Santa Perpetua de Mogoda, a methodology to quantify industrial's area metabolism is proposed. The methodology is analogous, consistent and comparable with the methods used for the other levels. The aim is to evaluate system's weak points and to quantify the improvements got through industrial symbiosis criteria.<br/>This analysis allows to evaluate a group of indicators which, when combined with other tools, could be useful to quantify the resource rate consumption and its consequences, to limit and to detect opportunities and weaknesses of the Catalan economic model.

Proyecto:

Producción de la lipasa LIP2 de Candida rugosa en el sistema Pichia pastoris: caracterización y aplicación en reacciones de síntesis

  • Alarcón Vivero, Manuel Rubén
Las lipasas son enzima con numerosas aplicaciones en biocatálisis debido a su reacción natural, hidrólisis de enlaces éster, como a su utilización en reacciones de transesterificación y síntesis orgánica. Se destaca como productor de lipasas la levadura Candida rugosa. Existen lipasas comerciales de este microorganismo, pero tienen el inconveniente de ser una mezcla de isoenzimas que hace inviable el proceso de purificación. La alternativa es la producción heteróloga de la lipasa 2 en otro microorganismo. No obstante, esta vía topa con la peculiaridad de que C. rugosa no sigue el código genético universal para el amino ácido serina. <br/>Con objeto de obtener el gen sintético, se diseñó y optimizó la secuencia nucleotídica de rLip2 para su expresión en Pichia pastoris, su inserción en el vector de expresión pPICZ&#945; bajo el control transcripcional del promotor de la alcohol oxidasa, su transformación en P. pastoris y la selección de clones productores de rLip2 activa. <br/>Comprobada la obtención de clones productores de rLip2 funcional, se determinó el pH óptimo de producción mediante estrategias de operación en discontinuo, paso previo a la optimización de la operación en discontinuo alimentado. <br/>Al trabajar con fermentaciones en discontinuo alimentado no se detectó presencia de actividad lipásica. Análisis por Western blot revelaron que estábamos en presencia se de agregados de rLip2, que no tenían actividad lipásica. <br/>La hipótesis que se planteó para justificar la formación de los agregados de rLip2 fue la elevada salinidad del medio de cultivo. Mediante la disminución de la fuerza iónica del medio mediante ultra y diafiltración se recupero la actividad enzimática, detectando el monómero de rLip2. La producción del producto heterólogo fue 10 veces superior a del microorganismo natural. <br/>Se realizó una caracterización bioquímica y funcional determinándose el óptimo de temperatura y pH, su especificidad frente a p-nitrofenoles y triglicéridos. El estudio de estabilidad demostró que la enzima recombinante en solución era menos estable que la nativa. No obstante, al inmovilizar la rLip2 se consiguió obtener una isoenzima más estable con el valor añadido de poder ser reutilizada. <br/>Finalmente, se realizaron aplicaciones biocatáliticas de rLip2 en reacciones de síntesis enantioméricas para la resolución de mezclas rácemicas de compuestos de interés farmacéutico. Si bien para la resolución racémica del trans-2-fenil-1-ciclohexanol, la rLip2 no fue tan efectiva como la isoenzima nativa, para la resolución del ibuprofeno, se obtuvieron mejores resultados en términos de conversión, exceso y factor enantiomérico que con la nativa., Lipases are enzymes with a wide range of applications in biocatalysis due to its natural reaction, hydrolysis of ester bounds, as well as to their use in transesterification and synthesis reactions. The yeast Candida rugosa is a well known lipase producer; there are several C. rugosa lipase preparations commercially available, but they have the inconvenience of being a mixture of several lipase isoenzymes with similar physicochemical properties, i.e. hampering the efficiency of their separation process. <br/>Thus, the recombinant production of C. rugosa lipases, particularly of the lipase 2 isoenzyme (Lip2), in another host microorganism is an attractive alternative. However, this strategy is hampered by the fact that C. rugosa may use a non-universal codon for Serine. We designed and synthesised a codon-optimised lip2 gene for its expression in Pichia pastoris. The synthetic gene was inserted into the pPICZ&#945; expression vector under the transcriptional control of the alcohol oxidase promoter, and cloned into P. pastoris. Transformants were selected in small scale cultivations for active rLip2 expression. In the following step, we determined the optimum pH for lipase production in preliminary bioreactor batch cultivations. However, when the producing strain was tested in fed-batch bioreactor cultivations, no lipolytic activity was detected in culture supernatants. Nevertheless, Western Blot analyses revealed that rLip2 was being produced as aggregates, with no apparent lipolytic activity. This observation suggested that the formation of rLip2 aggregates was related to the high ionic strength of the culture medium. Thus, cleared culture supernatants were subjected to ultra/diafiltration. By reducing the ionic strength of the cleared supernatant, the enzymatic activity could be recovered, also detecting the monomeric rLip2 form. Notably, the recovered lipase activity was 10-fold higher to that recovered from a cultivation process at the same scale with the native enzyme producer. The recombinant enzyme was biochemically and functionally characterized. In particular, we determined its optimum temperature and pH for activity, as well as its specificity towards p-nitrophenols and tryglycerides. Also, the stability study revealed that the recombinant enzyme is less stable than the native enzyme preparation. Nevertheless, when the rLip2 was immobilized on a solid support, stability was substantially improved, having the possibility of reuse as an additional advantage. Finally, the potential of rLip2 as a biocatalyst was tested in two different reactions of enantiomeric synthesis, for the resolution of racemic mixtures of compounds of pharmaceutical interest. Although rLip2 resulted to be less efficient than the native lipase preparation for the racemic resolution of trans-2-phenyl-1-ciclohexanol, the recombinant enzyme showed an improved performance (in terms of conversion, enantiomeric excess and enantiomeric factor) in relation to the native enzyme preparation for the resolution of ibuprofen.

Proyecto:

Cèl·lules mare mesenquimals humanes: aïllament, caracterització i potencialitat per a la regeneració cardíaca

  • Farré Crespo, Jordi
La insuficiència cardíaca congestiva és una epidèmia creixent a nivell mundial. Les causes principals de la insuficiència cardíaca estan relacionades amb el dany irreversible que resulta d'un infart de miocardi. El cor humà té una capacitat de regeneració limitada, i la pèrdua de múscul, juntament amb la contracció i la fibrosi de la cicatriu miocàrdica, posen en joc un conjunt d'esdeveniments anomenats remodelat ventricular, que finalment tendeixen cap a una insuficiència cardíaca congestiva. <br/>En l'actualitat no hi ha cap tractament o procediment clínic, amb excepció del trasplantament cardíac, que substitueixi la cicatriu de l'infart per teixit contràctil funcional. Recentment, la identificació de diferents tipus de cèl·lules mare capaces de contribuir a la regeneració dels teixits ha generat un notable interès en la possibilitat que la teràpia cel·lular pugui ser utilitzada per reparar el miocardi danyat (cardiomioplàstia cel·lular). No obstant això, es desconeix encara quin és el tipus cel·lular ideal per a la cardiomioplàstia cel·lular.<br/>Tradicionalment, es pensava que les cèl·lules mare pròpies d'un teixit adult només podien diferenciar-se cap a cèl·lules del teixit d'origen. Recentment, però, un conjunt d'estudis han demostrat que les cèl·lules mare adultes poden diferenciar-se cap a llinatges diferents als del seu teixit d'origen exhibint una plasticitat que ha estat anomenada transdiferenciació. Les cèl·lules mare mesenquimals són unes cèl·lules no hematopoètiques que típicament s'han aïllat del moll d'os però que més endavant s'ha demostrat que resideixen virtualment en tots els teixits. La seva accessibilitat, capacitat proliferativa, potencial de diferenciació i perfil immunològic fan que les cèl·lules mare mesenquimals adultes siguin un candidat principal per l'aplicació en teràpia regenerativa.<br/>En aquesta tesi hem aïllat i estudiat tres tipus de cèl·lules mare d'origen mesenquimal de tres teixits diferents, el moll d'os, el teixit adipós subcutani i el teixit adipós epicàrdic. Tots ells s'han caracteritzat in vitro i se n'ha estudiat la velocitat de creixement, la seva expressió de marcadors de superfície i la seva capacitat pluripotencial vers els llinatges adipogènic i osteogènic. La recerca en aquesta tesi però, s'ha centrat en el seu potencial per a la regeneració cardiovascular. Per aquest motiu es va estudiar el potencial cardiomiogènic mitjançant l'anàlisi de l'expressió basal de marcadors característicament cardíacs i la seva capacitat de diferenciació cap a cardiòcits. Dels resultats obtinguts en aquesta primera fase in vitro vam concloure que les cèl·lules progenitores derivades de greix epicàrdic (epiATPC), unes cèl·lules no descrites fins ara, eren el candidat cel·lular ideal per a l'estudi del seu potencial de regeneració del miocardi infartat in vivo. Per aquest motiu, es va estudiar l'efecte de les epiATPC trasplantades en dos models animals d'infart de miocardi en els quals es va observar una notable millora del miocardi infartat a nivell histològic i de funció. <br/>En conclusió, les epiATPC són una font cel·lular alternativa per a la cardiomioplàstia cel·lular, com ho demostra la seva capacitat de diferenciació cap a cardiòcit i cèl·lula endotelial, així com la millora de la funció cardíaca observada en els dos models d'infart agut de miocardi estudiats en aquest treball., Congestive heart failure is a growing epidemic worldwide. The main causes of heart failure are related to the irreversible damage that results from a heart attack. The human heart has a limited capacity for regeneration, and loss of muscle, along with contraction and fibrosis of the myocardial scar, put into play a series of events known as ventricular remodelling, which ultimately tend to congestive heart failure.<br/>At present there is no treatment or clinical procedure, with the exception of heart transplant, to replace the scar tissue for a viable tissue with contractile function. Recently, the identification of different types of stem cells capable of contributing to the regeneration of tissues has generated a significant interest in the possibility that cell therapy can be used to repair the damaged myocardium (cellular cardiomyoplasty). However, it is not known yet which cell type is ideal for the cellular cardiomyoplasty.<br/>Traditionally, it was thought that stem cells of an adult tissue could only differentiate itself into cells types of the tissue of origin. Recently, however, a number of studies have shown that adult stem cells can differentiate itself into different lineages of their tissue of origin displaying a plasticity that has been called transdifferentiation. Adult mesenchymal stem cells are a non-haematopoietic cells that typically have been isolated from the bone marrow but was later shown to reside in virtually all tissues. Its accessibility, proliferative capacity, potential for differentiation and immunological profile makes adult mesenchymal stem cells a primary candidate for the application in regenerative therapy.<br/>In this thesis we isolated and studied three types of stem cells of mesenchymal origin from three different tissues, bone marrow, subcutaneous fat and epicardic adipose tissue. All of them have been characterized in vitro and has studied the rate of growth, their expression of surface markers and their capacity towards the adipogenic and osteogenic lineages. Research in this thesis however, has focused on the potential for cardiovascular regeneration. That is why we studied the cardiomyogenic potential by analyzing the expression of basal characteristically cardiac markers and their ability to differentiate into cardiomyocytes. Based on the results obtained in this first phase in vitro we conclude that epicardial fat progenitor cells (epiATPC), a stem cell type not reported until now, were the ideal cell type for the study of their potential to regenerate myocardial infarction in vivo. For this reason, we studied the effect of epiATPC transplanted in two animal models of myocardial infarction in which there was a remarkable improvement of the infracted myocardium at histological and functional levels.<br/>In conclusion, epiATPC are an alternative cell source to cellular cardiomyoplasty, as demonstrated by their ability to differentiate into cardiomyocytes and endothelial cells, as well as the improvement of cardiac function observed in the two models of acute myocardial infarction studied in this work.

Proyecto:

Tractament de lleixius negres amb Trametes versicolor. Monitoratge del procés

  • Font i Segura, Xavier
En aquest treball s'utilitza el fong Trametes versicolor, per al tractament de lleixius negres. Aquestes aigües residuals, procedents de la industria paperera son molt tòxiques i contenen una elevada càrrega orgànica, constituint un veritable problema ambiental per aquelles empreses que les produeixen<br/>Després d'una introducció general sobre la producció del paper i la seva problemàtica ambiental, es continua amb la presentació dels resultats obtinguts. Aquests es presenten diferenciats en dos capítols:<br/>- Inicialment es presenten les investigacions realitzades en el tractament del lleixius negres amb el fong Trametes versicolor. Aquests treballs es varen iniciar amb erlenmeyer, determinat-se les condicons de treball en quant a temperatura agitació i concentració de glucosa. Seguidament es passà a realitzar assaigs amb bioreactors. S'han utilitzat diferents tipus de bioreactors i de diferents volums. S'ha treballat des de tancs agitats de 300 ml, fins a un reactor tipus air-lift de 2 l. Els millors resultats, però, s'han obtingut amb reactors de tipus llit fluiditzat de 450 ml i reactors de llit fix de 450 ml. S'ha treballat amb el fong en forma de pellets i amb el fong immobilitzat en cubs de niló i d'escuma de poliuretà. A partir dels resultats obtinguts s'ha estudiat tant, la relació entre la producció enzimàtica i els paràmetres ambientals seguits com, la relació entre si dels diferents paràmetres ambientals.<br/>- En un segon apartat es presenten els treballs duts a terme en el monitoratge del procés. En aquest sentit s'ha realitzat el muntatge d'un sistema d'adquisició de dades que inclou, mesura del pH i del pO2 i, mesures en línia, utilitzant la tècnica FIA (Flow Injection Analysis) del color, els compostos aromàtics i dels enzims lacasa i lignina peroxidasa. A més, en realitzar la validació del FIA de lignina peroxidasa amb lleixius negres, es va detectar un problema d'inhibició de l'enzim en presència de composts lignínics.<br/>El treball finalitza amb l'Apèndix, on s'inclouen una bona part dels programes, muntatges i circuits electrònics realitzats, que han estat utilitzats en el monitoratge del procés., En este trabajo se utiliza el hongo Trametes versicolor, para el tratamiento de lejías negras. Estas aguas residuales, procedentes de la industria papelera son muy tóxicas y contienen una elevada carga orgánica, constituyendo un verdadero problema ambiental en aquellas empresas que las producen.<br/>Después de una introducción general sobre la producción del papel y su problemática ambiental, se continúa con la presentación de los resultados obtenidos. Estos se presentan diferenciados en dos capítulos:<br/>- Inicialmente se presentan las investigaciones realizadas en el tratamiento del lejías negras con el hongo Trametes versicolor. Estos trabajos se iniciaron a escala erlenmeyer, determinándose las condiciones de trabajo en cuanto a temperatura agitación y concentración de glucosa. Seguidamente se pasó a realizar ensayos con biorreactores. Se han utilizado diferentes tipos de biorreactores y de diferentes volúmenes. Se ha trabajado con reactores de tanque agitado de 300 ml, así como con un reactor tipo air-lift de 2 l. Los mejores resultados, pero, se han obtenido con reactores de tipo lecho fluidizado de 450 ml y reactores de lecho fijo de 450 ml. Se ha trabajado con el hongo en forma de pellets y con el hongo inmovilizado en cubos de nylon y de espuma de poliuretano. A partir de los resultados obtenidos se ha estudiado tanto, la relación entre la producción enzimática y los parámetros ambientales seguidos como, la relación entre si de los diferentes parámetros ambientales.<br/>- En un segundo apartado se presentan los trabajos llevados a cabo en la monitorización del proceso. En este sentido se ha realizado el montaje de un sistema de adquisición de datos que incluye, medida del pH y del pO2 y, medidas en línea, utilizando la técnica FÍA (Flow Injection Analysis) del color, los compuestos aromáticos y de las enzimas lacasa y lignina peroxidasa. Además, al realizar la validación del FÍA de lignina peroxidasa con lejías negras, se detectó un problema de inhibición de la enzima en presencia de compuestos lignínicos.<br/>El trabajo finaliza con un Apéndice, dónde se incluyen una buena parte de los programas, montajes y circuitos electrónicos realizados, que han sido utilizados en la monitorización del proceso., In this work the white-rot fungus Trametes versicolor is used for the treatment of black liquors. This type of wastewaters, coming from the pulp and paper industry, are very toxic and they content a high organic load, constituting a significant environmental problem for those companies that produce them.<br/>A general introduction on the pulp and paper industry and its environmental problems is followed with the presentation of the obtained results. These results are shown in two main chapters:<br/>- Initially the research carried out with Trametes versicolor applied to the treatment of black liquor is shown. These works started at Erlenmeyer level, to determine the work conditions with respect to agitation, temperature and glucose concentration. Next, assays in bioreactor were carried out. Different types of bioreactors (with different volumes) have been used. Work was performed with agitated tanks of 300 ml, and air-lift type reactor of 2 l. The best results, however, were obtained when 450 ml bed fluidized reactor was used. Assays were performed with the fungus in the form of pellets and with the fungus immobilized in cubes of nylon and polyurethane foam. From the obtained results, correlations between the enzymatic production and the environmental parameters, and the correlation among the different environmental parameters, have been studied.<br/>- In a second chapter research carried out on process monitoring are presented. An automated system for on-line measurement of enzyme activity is proposed. The system uses a flow injection manifold in the stopped-flow mode to measure initial reaction rates. The time during which the flow is halted is selected in such a way as to optimise the enzyme/substrate ratio for the correct determination of activity values. The proposed system was used to determine the activity of laccase produced by the fungus Trametes versicolor immobilised on nylon in a fixed-bed reactor used for treating pulp mill waste water. Also a data acquisition system was developed for the monitoring of pH, pO2, color and aromatic compounds.

Proyecto:

Study of the effect of process parameters on the thermophilic anaerobic digestion of sewage sludge, evaluation of a thermal sludge pre-treatment and overall energetic assessment

  • Ferrer i Martí, Ivet
El consum energètic representa un 30 % dels costos d'operació en sistemes intensius de tractament d'aigües residuals urbanes. En depuradores convencionals que utilitzin un sistema de fangs activats, entorn al 15-20 % de l'energia és consumida en la línia dels fangs, que inclou el bombeig, l'espessiment, l'estabilització i la deshidratació. Per tant, la optimització de la gestió dels fangs pot contribuir substancialment en la reducció dels costos de tractament d'aigües residuals. La digestió anaeròbia termofílica és més eficient que la mesofílica i pscicrofílica, en termes de producció de biogàs i metà, eliminació de sòlids volàtils (SV) i destrucció de patògens. El procés es pot accelerar mitjançant el pre¬tractament dels fangs, afavorint la seva solubilització i hidròlisi. <br/>L'objecte d'aquesta Tesi Doctoral fou estudiar l'impacte dels paràmetres del procés en la digestió anaeròbia termofílica dels fangs de depuradora urbana, avaluar l'efecte del pre-tractament tèrmic dels fangs a baixa temperatura, i valorar processos alternatius des del punt de vista energètic. <br/>Els resultats experimentals presentats s'obtingueren mitjançant l'operació de dos reactors de laboratori durant prop de dos anys. En aquest període es va estudiar l'efecte de la temperatura del procés, del temps de retenció dels fangs (TRF), de la velocitat de càrrega orgànica (VCO) i del pre-tractament a 70 ºC en la digestió anaeròbia dels fangs de depuradora. El procés fou avaluat en termes de la producció d'energia (biogàs i metà) i de la qualitat del fang digerit (contingut de SV i d'àcids grassos volàtils (AGV), facilitat de deshidratació i higienització). S'analitzà l'estabilitat del procés a mesura que es reduïa el TRF i s'incrementava la VCO, i es comparà l'eficiència en períodes d'estabilitat corresponents a les diferents condicions operacionals. Finalment, s'avaluaren els resultats des del punt de vista energètic, mitjançant el càlcul de balanços i ratis energètics teòrics, que es compararen amb els resultats obtinguts a partir de dades experimentals d'altres estudis. També s'utilitzà un model cinètic de primer ordre. Les conclusions que es desprenen d'aquest treball es resumeixen a continuació: <br/>Durant la digestió anaeròbia dels fangs, la transició d'un reactor mesophilic (43 ºC) a termofílic (50 ºC) es podria dur a terme sense alterar el procés, treballant a TRF elevats (&#8805; 30 dies) i VCO baixes (&#8804; 0.5 kg SV m-3reactor d-1). En aquestes condicions, les principals diferències entre reactors termofílics (50-55 ºC) i mesofílics (38-43 ºC) fan referència a una certa acumulació d'AGV (0.5-2.5 g L-1) i millora de la destrucció de patògens (E. coli &#8804; 102 UFC mL-1). La digestió termofílica a 50 ºC i 55 ºC dóna lloc a resultats similars pel que fa a la producció de biogàs, estabilització, higienització i facilitat de deshidratació de l'efluent, si no varien els altres paràmetres operacionals. <br/>La producció de metà tendeix a incrementar proporcionalment a la VCO, és a dir al TRF i el contingut de SV als fangs alimentats. Així mateix, la qualitat de l'efluent (contingut de SV i AGV, facilitat de deshidratació dels fangs) també depèn de la VCO. D'acord amb els resultats obtinguts a 55 ºC, la producció de metà s'incrementà 2-3 vegades (de 0.2 a 0.4-0.6 m3CH4 m3reactor d-1) en disminuir el TRF de 30 a 15-10 dies, incrementant la VCO de 0.5 a 2.5-3.5 kg SV m3reactor d-1. En canvi, el procés es desestabilitzà amb la reducció del TRF a 6 dies i VCO per sobre de 5 kg SV m3reactor d-1. Les següents concentracions poden ser útils per detectar i prevenir la desestabilització d'un digestor termofílic de fangs: AGV totals <br/>(2.5 g L-1), acetat (0.5 g L-1), rati acetat/propionat (0.5), alcalinitat intermèdia (1.8 g CaCO3 L-1), rati alcalinitat intermèdia/alcalinitat parcial (0.9), rati alcalinitat intermèdia/alcalinitat total (0.5), contingut de metà al biogàs (55 %). <br/>El pre-tractament a 70 ºC afavoreix la solubilització dels fangs, incrementant la proporció de matèria orgànica soluble respecte la matèria orgànica total del 5 % al 50 % en 9-24 h; seguit d'una progressiva generació d'AGV després de 24h. Durant la subseqüent digestió anaeròbia de fangs pre¬tractats (9-48 h), s'incremetà la producció de biogàs en un 30-40 %, treballant a 55 ºC i 10 dies de TRF. El rendiment de producció de biogàs fou un 30 % superior amb fangs pre-tractats (0.28-0.30 vs. 0.22 L·gVS¬1) i el contingut de metà al biogàs també fou superior (69 % vs. 64 %). <br/>La digestió anaeròbia termofílica de fangs pot donar lloc a una producció neta d'energia, durant estacions fredes i càlides, si s'utilitzen reactors amb aïllament tèrmic de les parets i amb recuperació energètica a partir del biogàs i dels fangs digerits. En aquest cas, l'eficiència energètica de reactors termofílics treballant a la meitat de TRF (10-15 dies) que reactors mesofílics (20-30 dies) seria similar, per la qual cosa el cabal diari podria ser doblat, o el volum del reactor reduït, amb el conseqüent estalvi en el cost de tractament dels fangs. A més, un sistema en dues etapes (70/55 ºC) produiria més energia neta que un sistema en una sola etapa (55 ºC) amb un TRF de 10 dies. De totes maneres, la quantitat d'energia neta generada augmenta amb el volum del digestor donat que, malgrat la disminució en la producció de metà a TRF creixents, la producció d'energia segueix essent superior al consum, i per tant com més quantitat de fangs hi hagi al digestor, més energia es produirà., Energy consumption accounts for some 30 % of the total operating costs of intensive sewage treatment systems. In conventional wastewater treatment plants employing an activated sludge process, around 15-20 % of this energy is used in the sludge treatment line, including sludge pumping, thickening, stabilisation and dewatering. Therefore, optimisation of sludge management can substantially contribute in the reduction of wastewater treatment costs. Thermophilic anaerobic digestion is more efficient than mesophilic anaerobic digestion, in terms of biogas production, volatile solids (VS) removal and pathogens destruction. The process might be further accelerated by sludge pre-treatment, promoting sludge solubilization and hydrolysis. <br/>The aim of this PhD Thesis was to study the impact of process parameters on the thermophilic anaerobic digestion of sewage sludge, to evaluate the effect of implementing a low temperature pre¬treatment step, and to assess alternative processes from an energy perspective. <br/>The experimental results presented were obtained by operating two lab-scale reactors for almost two years. During this period, the effect of process temperature, sludge retention time (SRT), organic loading rate (OLR) and 70 ºC sludge pre-treatment on the anaerobic digestion of sewage sludge was studied. The process was evaluated in terms of energy production (i.e. biogas and methane production) and the quality of the effluent sludge (i.e. VS and volatile fatty acids (VFA) content, sludge dewaterability and hygienisation). Focus was put on the stability of the process at decreasing SRT and increasing OLR. Process efficiency during stable performance under each operating condition assayed was compared. Finally, the results were assessed from an energy perspective, by means of theoretical energy balances and ratios; and compared to the results obtained with experimental data from other studies. A first order kinetic model was also used. The conclusions drawn from the different issues dealt in this work are summarised as follows: <br/>During anaerobic sludge digestion, the transition from a mesophilic (43 ºC) to a thermophilic operation (50 ºC) may be carried out without disturbing the process, by operating the reactors at high SRT ( &#8805; 30 days) and low OLR (&#8804; 0.5 kg VS m-3reactor d-1). Under such conditions, some VFA accumulation (0.5-2.5 g L-1) and enhanced pathogen destruction (residual E. coli &#8804; 102 CFU mL-1) would be the main differences of thermophilic (50-55 ºC) compared to mesophilic (38-43 ºC) reactors. Thermophilic sludge digestion at 50 ºC and 55 ºC should be similar in terms of biogas production and effluent stabilisation, hygienisation and dewaterability; provided that other process parameters are the same. <br/>Methane production rate tends to increase proportionally to the OLR, thus to the SRT and VS concentration in the feed sludge. Similarly, the quality of the effluent sludge (VS content, VFA content and sludge dewaterability) is also affected by the OLR. According to the results obtained at 55 ºC, methane production rate increased by 2-3 times (from 0.2 to 0.4-0.6 m3CH4 m3reactor d-1) by decreasing the SRT from 30 to 15-10 days; increasing the OLR from 0.5 to 2.5-3.5 kg VS m3reactor d-1. However, process unbalance resulted from SRT reduction to 6 days, with OLR above 5 kg VS m3reactor d-1. The following concentrations might be useful to detect and prevent digester failure during thermophilic sludge digestion: total VFA (2.5 g L-1), acetate (0.5 g L-1), acetate/propionate ratio (0.5), intermediate alkalinity (1.8 g CaCO3 L-1), intermediate alkalinity/partial alkalinity ratio (0.9), intermediate alkalinity/total alkalinity ratio (0.5), methane content in biogas (55 %). <br/>The 70 ºC sludge pre-treatment may initially promote sludge solubilization, increasing the concentration of soluble to total organic matter from 5 to 50 % within 9-24 h; which is followed by a progressive VFA generation after 24 h. Subsequent anaerobic digestion of pre-treated sludge samples (9¬48 h) could increase biogas production by 30-40 % working at 55 ºC with a SRT of 10 days. Biogas yield is some 30 % higher with pre-treated sludge (0.28-0.30 vs. 0.22 L·gVSfed-1) and methane content in biogas is also higher with pre-treated sludge (69 vs. 64 %). <br/>Thermophilic anaerobic sludge digestion would result in net energy production, during cold and warm seasons, provided that digesters with wall insulation and with energy recovery from both the biogas produced and the effluent sludge are used. In this case, the energetic efficiency would be similar for thermophilic digesters working at half the SRT (10-15 days) of mesophilic digesters (20-30 days), meaning that the sludge daily flow rate could be doubled, or the reactor volume reduced, with subsequent savings in terms of sludge treatment costs. Furthermore, two-stage systems (70/55 ºC) may result in higher net energy production compared to single-stage systems (55 ºC) at 10 days SRT. However, the amount of surplus energy generated increases with digester volume. In spite of the decrease in methane production rate at increasing SRT, energy production is still higher than energy consumption, and therefore the bigger the amount of sludge in the digester, the higher the energy production.

Proyecto:

Análisis cuantitativo y modelización del metabolismo de la levadura Pichia pastoris

  • Santos de Jesus, Sérgio
El presente trabajo está centrado en el análisis y modelización del metabolismo central de la levadura Pichia pastoris. Concretamente, el objetivo de este trabajo consistió en analizar la distribución de flujos en las principales vías metabólicas del metabolismo central de esta levadura mediante distintas aproximaciones experimentales y matemáticas basadas en un modelo metabólico estequiométrico y compartimentalizado. Los datos experimentales fueron obtenidos en su mayor parte del trabajo de tesis de A. Solà (Solà, 2004, tesis doctoral, Universitat Autònoma de Barcelona), centrado en experimentos de marcaje isotópico con 13C de cultivos de P. pastoris operados en quimiostato a &#956;=0,05 y 0,16 h-1 con diferentes fuentes de carbono (glucosa, glicerol, metanol y mezclas de glicerol/metanol). Los datos fisiológicos experimentalmente obtenidos en dicho estudio se han reconciliado a través de ecuaciones de balances elementales y por grado de reductancia; además, se ha propuesto una ecuación estequiométrica para la formación de biomasa para cada condición de cultivo estudiada. Los datos reconciliados a través de ecuaciones de balances elementales se han usado para el análisis de flujos metabólicos; en primer lugar, se ha utilizado la metodología clásica; los resultados obtenidos en esta primera aproximación se compararon con datos experimentales previamente obtenidos mediante técnicas de marcaje isotópico de 13C por A. Solà. El segundo estudio ha consistido en el cálculo de flujos metabólicos introduciendo restricciones derivadas de cocientes de flujos metabólicos estimados experimentalmente mediante técnicas de 13C-RMN. Dado el reducido número de restricciones derivadas de experimentos de 13C-RMN que se pueden aplicar en este modelo metabólico (3 o 4), en un tercer estudio se ha realizado una primera aproximación a metodologías de simulación y optimización del diseño de experimentos de marcaje isotópico con el objetivo de implementar un procedimiento experimental que permitiera obtener datos suficientes para determinar con más precisión los flujos a través de determinadas rutas de la red, particularmente los relacionados a la vía de las pentosas fosfato (PP). Concretamente, para explorar esta estrategia se han realizado estudios para la optimización de un experimento de marcaje para un cultivo operado en quimiostato utilizando glicerol como fuente de carbono a &#956;=0,05h-1; la estrategia de marcaje optimizada se llevó posteriormente a cabo en el laboratorio y se analizó los patrones de marcaje de los principales metabolitos (incluyendo algunos aminoácidos) y aminoácidos proteinogénicos mediante LC-MS/MS y 2D-RMN, respectivamente. Ello ha permitido comparar y combinar datos experimentales obtenidos mediante dos estrategias de análisis para la estimación de flujos metabólicos. Así, globalmente, este trabajo permite concluir que el análisis clásico de flujos metabólicos (MFA) es una herramienta de cálculo que está limitada a redes poco complejas; sin embargo cuando se aplican restricciones derivadas del análisis por 13C-RMN al MFA, se observa que esta metodología de análisis presenta alta sensibilidad para la determinación de distribución de flujos metabólicos en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) y reacciones de transporte entre el citoplasma y la mitocondria. Por el contrario, utilizando una metodología de 13C-MFA basada en datos derivados de 13C-LC-MS, se observa que este método presenta poca sensibilidad en redes metabólicas compartimentalizadas, pues no permite distinguir los pools de metabolitos de un compartimiento dado (mitocondria/citoplasma). Sin embargo, este método presenta alta sensibilidad para la determinación de flujos a través de la vía de las PP. Así pues, la combinación de distintas metodologías basadas en datos de experimentos de marcaje isotópico ha permitido mejorar la información sobre el comportamiento del sistema. Finalmente, se ha llevado a cabo un análisis estructural de la red metabólica a través de la metodología del análisis de módulos elementales, así como una primera aproximación para su combinación con el análisis de flujos metabólicos basados en datos de marcaje isotópico con el objetivo de facilitar la interpretación fisiológica de los resultados, es decir, determinar cuales son las principales vías metabólicas activas bajo un estado fisiológico dado y cual es el flujo a través de dichas rutas., This study is focused on the analysis and modelling of the central carbon metabolism of the yeast Pichia pastoris. In particular, the major aim of this study was to analyze de flux distribution through the main metabolic pathways of the central metabolism of this yeast by jeans of different experimental and mathematical approaches, based on a stoichiometric and compartmentalized metabolic model. Experimental data was mostly obtained from previous studies from A. Solà (Solà, 2004, PhD thesis, Universitat Autònoma de Barcelona), describing isotopic labelling experiments with 13C of P. pastoris cells growing on chemostat cultures at a growth rate of &#956;=0.05 and 0.16 h-1, on different carbon sources (glucose, glycerol, methanol and mixtures of glycerol/methanol). The experimental physiological data obtained in A. Solà's study have been reconciliated by means of elementary and grade of reductance balance equations; moreover, a stoichiometric equation for the formation of biomass has been proposed for each of the studied growth condition. The data reconciliated by elementary balance equations have been used for metabolic flux analysis. <br/>First, the classic metabolic flux analysis methodology has been applied; the obtained results in this first approximation were compared with the experimental data previously generated from 13C-labeling experiments by A. Solà. <br/>Second, metabolic fluxes have been calculated introducing a number of restrictions derived from metabolic flux ratios experimentally estimated by 13C-NMR. <br/>Third, given the reduced number of restrictions derived from these experiments that are actually aplicable to the defined metabolic model (3 or 4), we performed a first approximation to methodologies for simulation and optimisation of isotopic labeling experiments; the aim of such approach was to implement an experimental procedure to allow for the generation of labelling data needed for the precise determination of fluxes through some pathways of the network, particularly those related to the pentose phosphate pathway (PPP). In order to explore this strategy, studies for the optimisation of a labelling experiment of cells growing on glycerol in chemostat cultures at a growth rate of 0.05 h-1 were performed. The optimised labelling strategy was subsequently implemented in the laboratory; the labelling patterns of the major metabolites (including some amino acids) of the central carbon metabolism and, of the proteinogenic amino acids, were analysed by LC-MS/MS and 2D-NMR, respectively. This allowed us comparing and combining experimental labelling data derived from two analytical strategies for the calculation of metabolic fluxes. <br/>Overall, this study illustrates that classic metabolic flux análisis (MFA) is a mathematical tool limited to networks of low complexity. Nevertheless, when restrictions derived from 13C-NMR analyses are introduced MFA, this methodology shows a high sensitivity for the calculation of the metabolic flux distribution in the tricarboxylic acid cycle (TCA) and transport reactions of TCA intermediates between cytoplasm and mitochondria. <br/>In contrast, by using a 13C-MFA methodology using data derived from 13C-LC-MS, we observe that this method shows low sensitivity for compartimentalized metabolic networks, as it did not allow distinguishing pools of a given metabolite found in different compartments (e.g. mitochondria/cytoplasm). Nevertheless, this method shows high sensitivity for determining fluxes through the PPP. <br/>In summary, the combination of different methodologies based on the use of data obtained from isotopic labelling experiments has allowed us to improve the information on the system's behaviour. In addition, a structural analysis of the metabolic network has been performed using the methodology of elementary modes analysis; moreover, a first approximation to its combination with metabolic flux analysis based on 13C-derived data has been proposed, with the objective to facilitate the physiological interpretation of the results, i.e. to assess which are the major active pathways under a given physiological state and to calculate the carbon fluxes through these pathways.

Proyecto:

Development of recombinant aldolase production process in Escherichia coli

  • Pinsach i Boada, Jaume
Aquest treball s'ha centrat en el desenvolupament del procés de producció d'aldolases recombinants en Escherichia coli.<br/>D'una banda, el procés de producció de fuculosa 1-fosfat aldolasa (FucA) recombinant va ser automatitzat utilitzant un sistema d'expressió basat en un promotor feble induïble per IPTG. Donat que la inducció en forma de pols no afectava de forma significativa el metabolisme cel·lular fins que s'havia assolit un alt rendiment de producte, es va implementar un control robust del procés mitjançant l'automatització d'alimentació exponencial de substrat. Es van obtenir cultius d'alta densitat cel·lular controlant la velocitat específica de creixement a nivells de substrat limitants. El llaç de control utilitzat es va basar en l'estimació indirecta de la biomassa (utilitzant l'anàlisi dels gasos de sortida) i balanços de matèria.<br/>D'altra banda, es va desenvolupar el procés de producció de ramnulosa 1-fosfat aldolasa (RhuA) recombinant utilitzant un sistema d'expressió basat en un promotor fort induïble per IPTG. Estudis preliminars d'expressió obtinguts en cultius en erlenmeyer van indicar que l'ús d'un promotor fort presentava importants avantatges. En comparació amb el sistema d'expressió basat en un promotor feble, es van obtenir alts rendiments de producte en terminis més curts i amb menors requeriments d'inductor. No obstant això, el sistema va resultar ser extremadament sensible a la inducció en cultius d'alta densitat cel·lular. Per tant, es va prestar especial atenció al desenvolupament de les estratègies de procés més adients.<br/>En primer lloc, el desenvolupament del procés es va centrar en l'aplicació estratègies d'inducció alternatives en cultius d'alta densitat cel·lular. Tot i que en els estudis preliminars d'expressió s'havien aconseguit elevades activitats específiques, es van mesurar valors inferiors en cultius d'alta densitat cel·lular induïts amb polsos d'IPTG. Les condicions que provocaven un xoc metabòlic a les cèl·lules es van identificar i evitar mitjançant l'aplicació d'una estratègia d'addició contínua d'inductor. Aquesta estratègia va permetre la modulació de la velocitat d'expressió de la proteïna, de tal manera que la durada de la fase de producció es va estendre, els requeriments d'inductor van disminuir i es van assolir elevats rendiments de producte. Tot i això, els resultats encara indicaven una menor activitat específica de l'enzim que en el cas dels estudis preliminars d'expressió. <br/>Disminucions de l'activitat enzimàtica s'han atribuït sovint a l'estrès degut a un excés de temperatura (ja sigui traduït en un mal plegament de la proteïna i/o a proteòlisi en sí), de tal manera que es va dur a terme l'optimització de la temperatura del procés. En aquestes condicions es van mesurar velocitats de producció específiques més baixes, però es va aconseguir millorar significativament els rendiments de RhuA activa.<br/>També es van dur a terme estudis preliminars de modelització del procés. Tot i que no va ser possible calibrar un model de producció prou robust com per descriure totes les situacions que podrien ocórrer (i, per tant, l'optimització matemàtica de l'estratègia del procés no seria fiable), els estudis van permetre la identificació dels aspectes més importants del procés així com dels colls d'ampolla d'aquest.<br/>Aquesta informació va permetre desenvolupar una estratègia de creixement alternativa amb l'objectiu de reduir l'estrès cel·lular degut a la limitació de substrat. Mitjançant el control dels nivells de glucosa al bioreactor, es van obtenir cultius d'alta densitat cel·lular a nivells de substrat inhibitoris per evitar l'acumulació d'acetat. Després de l'optimització de l'estratègia d'inducció, es van obtenir alts rendiments de producte així com una elevada activitat específica de l'enzim.<br/>Finalment, es va realitzar un anàlisi global del procés de producció. Donat que l'objectiu era obtenir un enzim immobilitzat per ser utilitzat com biocatalitzador, les diferents estratègies de producció van ser comparades tenint en compte el seu impacte en les etapes posteriors de purificació i immobilització. Els resultats van mostrar que les estratègies alternatives de procés que s'havien desenvolupat en aquest treball augmentaven significativament els rendiments específics de RhuA immobilitzada activa respecte a l'anterior estratègia. Aquests resultats van posar de manifest la necessitat d'optimitzar la producció de proteïnes recombinants considerant tant el procés de producció com les fases posteriors de purificació i immobilització conjuntament., This work has been focused on the development of recombinant aldolase production process in Escherichia coli. <br/>On the one hand, the production process of recombinant fuculose 1-phosphate aldolase (FucA) was automated when using an expression system based on an inducible weak promoter. Since pulse induction did not significantly affect the host cell metabolism until high product yields were reached, a robust process control could be implemented by automating an exponential substrate feed. High cell density cultures were obtained at limiting substrate levels by controlling the specific growth rate. The implemented control algorithm used a simple feedback loop based on indirect biomass estimation (using exhaust gas analysis) and mass balances.<br/>On the other hand, the production process of recombinant rhamnulose 1-phosphate aldolase (RhuA) using an expression system based on an inducible strong promoter was developed. Results obtained from preliminary expression studies performed in shake flask cultures indicated that the use of a strong promoter presented important advantages. When compared to the expression system based on a weak promoter, high product yields were obtained in shorter times, and lower amounts of inducer were required. However, when going to high cell density cultures, the system was found to be extremely sensitive to induction. Thus, special attention was paid on the development of suitable process strategies.<br/>First, process development was focused on the implementation of alternative induction strategies in high cell density cultures. While high intracellular specific activities were achieved in shake flasks, lower specific values were measured in standard pulse-induced fed-batch cultures. The conditions under which high metabolic load on host cells compromised the productivity of the process were identified and avoided by implementing a continuous inducer addition strategy. When tuning protein expression rates, the length of the production phase was extended, the requirements of inducer were decreased and high product yields were achieved. However, results still showed lower specific enzyme activity than in the case of preliminary expression studies.<br/>Since decreased enzyme activity has been often attributed to temperature-driven stress (translated into either protein misfolding and/or proteolysis itself), optimisation of process temperature was carried out. Lower specific production rates were measured at a reduced process temperature, but significant improvement was achieved in terms of bioactive RhuA yields. <br/>Besides, preliminary studies on process modelling were carried out. Even though it was not possible to calibrate a production model robust enough to describe all situations which could potentially occur (and, thus, mathematical optimisation of the process strategy would not be reliable), insight of the process was gained, and some of the process bottlenecks and unknown key features were identified.<br/>From these learnings, an alternative growth strategy was then developed to minimise the starvation induced-stress on host cells. High cell density cultures were obtained at non-limiting substrate levels by controlling the glucose concentration in the culture at inhibiting values to avoid acetate accumulation. After optimising the induction strategy, high product yields as well as high specific enzyme activities were obtained.<br/>Finally, an analysis of the global production process was performed. Since the aim of the whole process was to obtain an immobilised enzyme ready to be used as biocatalyst, all different production strategies were compared taking into account their impact on downstream yields. When doing so, results showed that the alternative process strategies which had been developed in this work significantly increased the immobilised specific yields of active RhuA with respect to the previous strategy. These results reinforced the need to optimise recombinant protein production processes considering both the production and downstream stages as a whole.

Proyecto:

Estratègies d'operació en el procés de producció de proteïnes heteròlogues en Pichia pastoris: aplicació de tècniques de monitorització i control

  • Ramon Real, Ramon
El desenvolupament de bioprocessos productius reproduïbles i escalables s'ha convertit en un dels colls d'ampolla a mesura que es consolida l'obtenció de proteïnes recombinants. Per poder superar-ho, la FDA i la EMEA han posat en marxa la iniciativa Process Analytical Technologies (PAT) que cerca el desenvolupament de processos productius eficients i controlats i que serveix de marc pel desenvolupament del present treball.<br/>El treball desenvolupat te com a objectiu el desenvolupament i implementació d'eines que permetin monitoritzar i controlar els processos de producció amb el llevat metilotròfic P. pastoris. <br/>Aquest objectiu es materialitza en forma de un desenvolupament d'eines per la correcta monitorització de paràmetres i variables associats al procés productiu, com són el desenvolupament d'un sistema automàtic de presa de mostra, el desenvolupament d'eines per a l'eliminació d'interferències per un sensor en línea de metanol, el desenvolupament d'un sistema en línea de compostos amínics i el desenvolupar un software sensor que permeti determinar en línea la velocitat específica de creixement de P. pastoris en base a un algoritme d'identificació RLS. A més a més, s'ha implementat un sistema de control per a poder analitzar l'efecte de la concentració de metanol en una soca de fenotip Mut+ de P. pastoris sobre la productivitat del procés productiu i posteriorment s'ha avaluat l'efecte de la utilització de substrats mixtes per a la producció de proteïnes recombinants pels fenotips Muts i Mut+ de P. pastoris.<br/>Paraules clau<br/>Discontinu alimentat, Pichia pastoris, substrats mixtes, bioprocés, control, optimització, RLS, El desarrollo de bioprocesos productivos reproducibles y escalables se ha convertido en uno de los cuellos de botella a medida que se consolida la obtención de proteínas recombinantes. Para poder superarlo, la FDA y la EMEA han puesto en marcha la iniciativa Process Analytical Technologies (PAT) que busca el desarrollo de procesos productivos eficientes y controlados y que sirve de marco para el desarrollo del presente trabajo.<br/>El trabajo desarrollado tiene como objetivo el desarrollo e implementación de herramientas que permitan monitorizar y controlar los procesos de producción de la levadura metilotrófica P. pastoris. <br/>Este objetivo se materializa en forma de un desarrollo de herramientas para la correcta monitorización de parámetros y variables asociadas al proceso productivo, como son el desarrollo de un sistema automático de toma de muestra, el desarrollo de herramientas para la eliminación de interferencias para un sensor en línea de metanol, el desarrollo de un sistema en línea de medida de la concentración de compuestos amínicos y el desarrollo de un software sensor que permita determinar en línea la velocidad específica de crecimiento de P. pastoris en base a un algoritmo de identificación RLS. Además, se ha implementado un sistema de control para poder analizar el efecto de la concentración de metanol en una cepa de fenotipo Mut+ de P. pastoris sobre la productividad del proceso productivo y posteriormente se ha evaluado el efecto de la utilización de sustratos mixtos en la producción de proteínas recombinantes para los fenotipos Muts y Mut+ de P. pastoris.<br/>Palabras Clave<br/>Discontinuo alimentado, Pichia pastoris, substratos mixtos, bioproceso, control, optimización, RLS, The development of reproducible and scalable productive bioprocesses has become one of the bottlenecks for the production of recombinants proteins. In order to overcome it, the FDA and the EMEA have started off the Process Analytical Technologies (PAT). That initiative looks for the development of efficient and controlled productive processes and is in this concept where the present work is framed.<br/>The goal of this experimental work is the development and implementation of tools that allow monitorization and control of P. pastoris production processes.<br/>This goal is materialized with the creation and implementation of tools for the correct monitorization of parameters and state variables of the productive process, such as the development of an automatic sampling system, the development of tools for the elimination of interferences of an on-line methanol sensor, the development of an amine compounds analyzer and the development of a sensor software that allows to gauge the specific growth rate of P. pastoris using a RLS identification algorithm. Moreover, a methanol control system has been implemented for analyzing the effect of the substrate concentration in the productivity on a P. pastoris (phenotype Mut+) culture. And finally it has been analyzed the effect of mixed substrate strategy in Muts and Mut+ phenotypes of P. pastoris for the production of recombinant proteins. <br/>Key words<br/>Fed-batch, Pichia pastoris, mixed substrates, bioprocess, control, optimization, RLS.

Proyecto:

Mathematical modelling and molecular analysis of a nitrifying packed bed biofilm reactor

  • Montràs Boet, Anna
MELiSSA (Micro Ecological Life Support System Alternative) és el sistema desenvolupat per l'Agència Espacial Europea (ESA) i el consorci MELiSSA en el camp del suport de vida durant missions de llarga durada a l'espai. Basat en un ecosistema aquàtic, MELiSSA va ser concebut com una eina per desenvolupar la tecnologia necessària per a un sistema de suport de vida biològic que en un futur ha de permetre la producció d'aliment, aigua i oxigen a partir dels residus orgànics generats per una tripulació. <br/>Per assolir aquest objectiu, el concepte MELiSSA compta amb l'activitat combinada de cinc compartiments colonitzats per diferents microorganismes i plantes superiors, interconnectats entre ells. Aquesta tesi es centra en el tercer compartiment del bucle MELiSSA, en el qual l'amoni és convertit a nitrat, que és la font de nitrogen més adequada per al creixement dels cianobacteris i plantes superiors que colonitzen els compartiments fotosintètics. <br/>L'oxidació biològica d'amoni a nitrat té lloc en dues etapes successives que porten a terme dos tipus de soques bacterianes. En el projecte MELiSSA aquest procés es porta a terme en una columna de llit fix mitjançant Nitrosomonas europaea i Nitrobacter winogradkyi immobilitzats sobre un suport polimèric, i amb aportació d'aire en el mateix sentit de circulació que el medi líquid. El reactor pilot del tercer compartiment ha estat operant a la planta pilot del projecte MELiSSA durant períodes prolongats de temps abans de l'inici del treball realitzat en aquesta tesi. <br/>La principal aportació d'aquesta tesi es troba en l'obtenció de nova informació sobre el funcionament del reactor a través d'un estudi detallat de la biopel·lícula i també mitjançant el desenvolupament d'un model matemàtic que ens permetrà estudiar els efectes de diferents paràmetres d'operació sobre el procés i l'estructura de la biopel·lícula. S'implementaran també els aparells de mesura necessaris per millorar la qualitat de la monitorització de les diferents espècies de nitrogen a la fase líquida. Els coneixements adquirits en la realització d'aquest treball seran utilitzats per portar a terme el re-disseny del reactor per tal de millorar-ne el funcionament dins de la planta pilot del projecte MELiSSA., MELiSSA (Micro Ecological Life Support System Alternative) is the system developed by the European Space Agency (ESA) and the MELiSSA consortium in the field of life support for long term manned missions in Space. Based on the principle of an aquatic ecosystem, MELiSSA was conceived as a tool to develop the required technology for a future biological life support system. Its final aim is the production of food, fresh water and oxygen from the organic wastes of a crew. <br/>To achieve this goal, the MELiSSA concept is based on the use of five interconnected compartments colonised by several microorganisms and higher plants. This thesis is focused on the third compartment of the MELiSSA loop, in which ammonium is converted to nitrate, the most suitable nitrogen source for the growth of the bacteria and higher plants colonising the photosynthetic compartment. The biological oxidation of ammonium to nitrate, which consists of two successive reactions carried out by two different bacterial strains, takes place in a packed bed biofilm reactor. Nitrosomonas europaea and Nitrobacter winogradskyi are immobilised on a polymeric support, with air flowing cocurrently with the feed medium. The pilot-scale reactor of compartment III (CIII) had been in operation in the MELiSSA pilot plant for several years before the start of the present work. <br/>The main contributions of this thesis are in increasing the understanding of the reactor performance by studying the nitrifying biofilm in depth, and by developing a mathematical model that allows the effects of different operational parameters on the process and on the biofilm structure, to be studied. Moreover, continuous monitoring of the nitrifying efficiency will be improved by installing the necessary on-line equipment to experimentally measure the concentrations of all the nitrogen species in the liquid phase. The additional knowledge achieved on the reactor performance via this work will finally lead to re-design the reactor hardware for optimal performance in the MELiSSA pilot plant. <br/>The knowledge acquired in this thesis was finally used to define the main features of the re-design of the pilot reactor of the MELiSSA compartment III.

Proyecto:

Millora en el procés de producció d'una lipasa de Rhizopus oryzae en Pichia pastoris mitjançant tècniques de monitoratge i estratègies de cultiu alternatives

  • Surribas i Casalprim, Anna
En aquest treball s'exposen dues línies de recerca centrades en el procés de producció d'una lipasa de Rhizopus oryzae (ROL) en Pichia pastoris: la utilització de diferents tècniques de monitoratge i l'aplicació d'estratègies de cultiu que permetin millorar la producció de la ROL en una soca Mut+ d'aquest sistema d'expressió. <br/>En els cultius discontinus alimentats amb P. pastoris cal disposar d'una mesura en línia i en temps real de la concentració de substrat, el metanol. Per això es va desenvolupar un analitzador d'injecció seqüencial. Es va comprovar que aquest té una freqüència d'anàlisi òptima per a cultius amb la soca Muts però baixa per a la soca Mut+. Amb aquesta última soca, es van utilitzar i comparar dos mesuradors comercials en fase gas. <br/>Es va avaluar també la fluorimetria com a tècnica de monitoratge per a la determinació de tres variables clau: la biomassa, el substrat (glicerol/metanol) i la proteïna recombinant.<br/>Inicialment es va fer un seguiment de l'evolució de la biomassa a partir del senyal de fluorescència off-line del triptòfan. Es pot predir la biomassa correctament però es van evidenciar diferents desavantatges: la necessitat de dilució de les mostres i d'un sistema de presa de mostra específic. Per això es va decidir aplicar i avaluar la fluorimetria multivariable in situ. <br/>Amb la utilització d'una sonda fluorimètrica in situ, combinada amb mètodes quimiomètrics de tractament de dades multivariables, es va aconseguir predir la biomassa i el substrat a partir de la determinació del senyal de diversos fluoròfors. No es va aconseguir una bona predicció de la producció de ROL. <br/>Per millorar el seguiment de la proteïna, es va fusionar a la GFP. Es van detectar dos inconvenients: els nivells de producció disminuïen respecte a la producció de ROL únicament i la riboflavina, que Pichia excreta al medi, interferia amb el senyal de fluorescència del mutant de GFP escollit. Tant amb la filtració de la mostra abans de la determinació del senyal de GFP com si s'hagués escollit un mutant de GFP amb emissió més allunyada de la riboflavina es podria haver evitat aquest inconvenient i fer un seguiment de la ROL excretada. Es pot seguir la ROL intracel·lular.<br/>Quant a la producció de la ROL, es va estudiar l'efecte del nivell de metanol residual en cultius discontinus alimentats amb la soca Mut+. Existeix una concentració òptima entorn els 2.5 g·l-1 de metanol al medi. A concentracions superiors es va apreciar inhibició per substrat. Es va observar un fenomen de limitació per transferència d'oxigen al final del cultiu i una important disminució de la viabilitat cel·lular.<br/>Per això, es van avaluar estratègies de cultiu alternatives. Primer es va aplicar una estratègia de metanol limitant (MLFB) per evitar la limitació d'oxigen al final d'un cultiu a 2.5 g·l-1 de metanol residual (MNLFB). Es va millorar la productivitat un 40%. En segon lloc, es va aplicar una estratègia de temperatura limitant per avaluar el seu efecte sobre la producció. No es van millorar els resultats. Finalment, es va aplicar una estratègia MNLFB a 2.5 g·l-1 de metanol però amb un medi amb una menor osmolaritat i una fase final amb limitació de temperatura per evitar la limitació d'oxigen. Es va aconseguir reduir la mortalitat cel·lular però la productivitat disminuïa respecte el cultiu on s'aplica una fase de MLFB al final de la inducció. Tot i això, es va obtenir un producte final un 30% més pur en quant a activitat lipolítica respecte la proteïna total. <br/>Posteriorment es va procedir a escalar la producció en planta pilot. Es va observar limitació en la transferència d'oxigen en fases inicials de la inducció. Això va originar l'aparició d'un subproducte, associat a una reducció en la producció de ROL extracel·lular. En millorar la transferència d'oxigen es va minimitzar aquesta limitació i va millorar la producció. No es van aconseguir els mateixos nivells de productivitat que a escala laboratori però es continua treballant en la millora de la transferència de matèria per assolir-los., In this work two research lines, applied to the production of a Rhizopus oryzae lipase (ROL) in Pichia pastoris, are shown: the application of different monitoring and cultivation techniques to improve ROL production in a P. pastoris Mut+ strain.<br/>During P. pastoris fed-batch cultures, methanol needs to be on line measured and monitored in real time. For this purpose, a sequential injection analyzer was developed. Although it presented a suitable analysis frequency for a Muts strain it was too low for a Mut+ strain. When the later was used, two different methanol commercial sensors in the outlet gas steams were utilized and compared. <br/>Fluorometry was also evaluated as a monitoring technique for three key variables: biomass, substrate (glycerol/methanol) and recombinant protein. <br/>Initially, biomass was followed by the off-line determination of tryptophan's fluorescence. Biomass was correctly predicted with this system but different disadvantages appeared: the need of a sample dilution procedure and a specific sampling device. Therefore, multivariable in situ fluorometry was subsequently evaluated. <br/>By means of an in situ multivariable fluorimetric probe, combined with chemometric methods to data processing, biomass and substrate prediction was properly achieved. ROL production could not be satisfactorily estimated.<br/>To improve ROL monitoring, it was fusioned to the green fluorescent protein (GFP). Two main disadvantages were found: production levels were lower when compared to solely ROL expression and riboflavin, naturally excreted by the yeast, interfered to GFP's signal. This problem could be solved with sample filtration prior to GFP's measurement and also if a different GFP mutant had been chosen with emission signal further to riboflavin's.<br/>With respect to ROL production, the effect of methanol concentration was studied in Mut+ fed-batch cultures. There is an optimal methanol concentration about 2.5 g·l-1. Substrate inhibition was observed at higher methanol levels. Oxygen transfer limitation at the end of the induction phase and an important cell viability decrease were also found. <br/>Therefore, alternative culture techniques were evaluated. First a methanol limited fed-batch phase (MLFB) was applied when oxygen limitations appeared at the end of a 2.5 g·l-1 methanol fed-batch phase (MNLFB). Productivity increased up to 40% with this strategy. Secondly, a temperature limited fed-batch was applied. No better results were obtained compared to the reference MNLFB culture. Finally, a 2.5 g·l-1 methanol fed-batch was applied with a lower salt content medium and a final temperature limited phase when oxygen limitation appeared. Cell death was reduced but productivity decreased with respect to the reference MNLFB culture. However, a 30% purer lipase was obtained in terms of lipase activity to total protein.<br/>Thereafter, the scaling of the production process in a pilot plant was evaluated. Oxygen limitation was found in the early induction phase. This caused a byproduct secretion associated to a ROL production decrease. When oxygen transfer was enhanced, byproduct secretion was reduced and ROL production improved. Similar laboratory scale productivities were not achieved but oxygen mass transfer is being further enhanced to reach the objective levels.

Proyecto:

Buscador avanzado