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Bases moleculares de la depleción de glutatión y de la necrosis celular en la pancreatitis aguda. Papel de las proteín quinasas activadas por mitógenos.

  • Pereda Cervera, Javier
RESUMEN La pancreatitis aguda es el proceso inflamatorio agudo del páncreas con afectación variable de otros tejidos regionales y sistemas orgánicos alejados. Es una enfermedad con una incidencia relativamente elevada en España y en el resto del mundo y con una mortalidad entre el 10 y el 45% de los casos graves de la enfermedad. Los mecanismos moleculares por los que una pancreatitis aguda se desarrolla, así como aquellos que conducen a una pancreatitis grave, aún no están del todo esclarecidos. Se ha descrito que el glutatión, que es el antioxidante intracelular más abundante de la célula, sufre una depleción en modelos de pancreatitis experimental. Esta depleción está relacionada con mayor gravedad de la enfermedad, así como mayor mortalidad de las células acinares por necrosis. El objetivo de la presente tesis ha sido determinar los mecanismos responsables de la depleción de glutatión en el páncreas en la pancreatitis aguda experimental. Utilizando dos modelos experimentales de pancreatitis aguda se han obtenido las siguientes conclusiones: En la pancreatitis aguda necrótica inducida con taurocolato en ratas se produce una depleción severa y precoz de glutatión reducido en el tejido pancreático. Esta depleción se mantiene durante al menos nueve horas tras la inducción de la pancreatitis. Se observa una inducción ineficaz de la -glutamil cisteína sintetasa en páncreas durante la pancreatitis aguda severa que podría contribuir a la depleción mantenida de glutatión. En la pancreatitis aguda necrótica inducida con taurocolato no aumenta la expresión de las subunidades de la -glutamil cisteína sintetasa durante las primeras horas, a pesar de la unión de la ARN polimerasa II tanto a los promotores como a los exones de los genes que codifican las subunidades de esta enzima. Sin embargo, en la pancreatitis aguda edematosa inducida en ratas con ceruleína se produce de forma precoz un gran aumento en la expresión de la subunidad catalítica de la -glutamil cisteína sintetasa. Esta marcada inducción se debe principalmente a la unión de los factores de transcripción NF-B, SP-1 y c-Myc al promotor. En la pancreatitis aguda experimental inducida con taurocolato se produce de forma temprana un aumento en la fosforilación de las quinasas ERK 1/2, JNK y p38 en el páncreas. Posteriormente, desciende progresivamente la fosforilación de las mismas hasta alcanzar niveles semejantes al control a las seis horas tras la inducción. El tratamiento con pentoxifilina previene la fosforilación de ERK 1/2 y de JNK, mientras que el oxipurinol previene la fosforilación de p38. El tratamiento combinado con pentoxifilina y oxipurinol previene simultáneamente la fosforilación de las tres principales familias de MAP quinasas. El TNF- no tiene un papel significativo en la depleción de glutatión en la pancreatitis aguda dado que la depleción de glutatión asociada a la pancreatitis aguda inducida por ceruleína se produce tanto en ratones control wild type como en ratones knockout de TNF- o de los receptores de TNF-. La inhibición de la vía de ERK previene la depleción de glutatión inducida con taurocolato in vitro tanto en células acinares como en células AR42J. No obstante, JNK y p38 no influyen significativamente en esta depleción de glutatión. El inhibidor de proteasas AEBSF previene la depleción de glutatión inducida por taurocolato en células AR42J. Sin embargo, las proteasas lisosomales, el proteasoma, el calcio y la -glutamil transpeptidasa no juegan un papel significativo en la depleción de glutatión. El AEBSF, inhibidor de la depleción de glutatión, disminuye la necrosis inducida por taurocolato en células AR42J, aumentando la muerte celular por apoptosis. Por tanto, nuestros resultados sugieren que la depleción de glutatión en páncreas en la pancreatitis aguda se debe a una proteasa o peptidasa no lisosomal dependiente de MAP quinasas, no dependiente de calcio e inhibible por AEBSF. __________________________________________________________________________________________________, Acute pancreatitis is an inflammation initially localized in the pancreatic gland which may lead to local and systemic complications. The development of severe acute pancreatitis is mediated by pathophysiological mechanisms involved in the systemic inflammatory response, cytokines and oxidative stress being their components of major importance. Nevertheless, it is still unknown why an episode of acute pancreatitis remains mild or progresses to a severe form. Glutathione depletion occurs in pancreas during acute pancreatitis and it has been related to necrosis cell death and severity of the disease. The aim of this study is to clarify the mechanism involved in glutathione depletion in experimental acute pancreatitis. Taurocholate-induced acute pancreatitis was used as a severe experimental model of the disease whereas caerulein-induced acute pancreatitis was used as a mild experimental model. Results showed that ineffective induction of -glutamil cistein synthetase occurs after taurocholate-induced acute pancreatitis. However, caerulein induced pancreatitis produced high expresion of this enzyme. Taurocholate-induced acute pancreatitis showed early activation of the three major families of mitogen-activated protein kinases. In this model, pentoxifylline prevented JNK and ERK activation while oxypurinol prevented p38 activation. Combined treatment of pentoxifylline and oxypurinol almost abolished MAPK phosphorylation in the pancreas. TNF- did not play an important role in glutathione depletion because this depletion associated with caerulein-induced pancreatitis occurred similarly in wild type mice, TNF- knockout mice and TNF- receptor knockout mice. ERK inhibition prevented taurocholate-induced glutathione depletion in acinar cells and AR42J cells. However, JNK and p38 were not implicated in glutathione depletion produced by taurocholate in this cell line. AEBSF, a serin protease inhibitor, prevented glutathione depletion in AR42J cells. In addition, AEBSF diminished taurocholate-induced necrosis increasing apoptosis cell death. Conversely, lysosomal proteases, proteasome, calcium and -GT did not play a significant role in glutathione depletion in AR42J. Therefore, our results suggest that glutathione depletion occurs not by lysosomal but MAP kinase-dependent, calcium-independent protease or peptidase which is inhibited with AEBSF.
Proyecto:


Estudio del estrés oxidativo hepático en un modelo in vivo de deficiencia en vitamina E. Papel de NF-kappaB en la regulación de los genes de la gamma-glutamilcisteína sintetasa y genes implicados en el control del ciclo celular.

  • Morante Hernández, María
RESUMEN La vitamina E es un nutriente esencial que actualmente está recibiendo una considerable atención pública. Sus potentes propiedades antioxidantes -principalmente como inhibidor de la peroxidación lipídica- han puesto de manifiesto su importancia en la prevención y tratamiento de enfermedades en las que el estrés oxidativo interviene como componente destacado en su etiología o desarrollo; entre estas enfermedades se encuentran alteraciones tan importantes en la actualidad como son los trastornos cardiovasculares, el cáncer, la inflamación crónica y los trastornos neurodegenerativos. La deficiencia severa en vitamina E raramente ocurre en humanos como consecuencia de una deficiencia dietética. Sin embargo, esta deficiencia puede producirse como resultados de anormalidades genéticas en la -TTP y como resultado de determinados síndromes de malabsorción. Además de estas alteraciones, conviene destacar que el incremento de población envejecida, cuyos requerimientos antioxidantes son más elevados, así como la tendencia actual a consumir dietas bajas en grasas conlleva que gran parte de la población no llegue a consumir los requerimientos mínimos de vitamina E. A pesar de que numerosos trastornos hepáticos tales como fibrosis y cirrosis, entre otros, cursan con deficiencia en vitamina E, la mayoría de modelos de deficiencia in vivo han basado su estudio en tejidos como el sistema nervioso central y el músculo, cuya afectación es aparentemente la responsable de gran parte de la sintomatología de la deficiencia, mientras que el hígado ha sido relativamente poco estudiado, desconociéndose en gran medida los procesos moleculares que tienen lugar en este tejido como consecuencia de la depleción de vitamina E. En este contexto de alteraciones hepáticas, el factor de transcripción sensible al estado redox NF-kappaB (NF-B) ha sido implicado como mediador en procesos de daño hepático inducido por el estrés oxidativo. El propósito de este estudio es determinar la actividad de unión de NF-B al DNA hepático y la respuesta de genes diana sensibles al estado redox y genes moduladores del ciclo celular en un modelo in vivo de deficiencia crónica en vitamina E. Para ello, se alimentaron ratas Wistar con una dieta control o deficiente en vitamina E hasta los 60 o 90 días tras el nacimiento. Las ratas deficientes en vitamina E mostraron un incremento progresivo en los niveles de malondialdehído y un descenso en la concentracion de glutatión tanto en hígado total como en mitocondria aisladas de hígado. La deficiencia en vitamina E incrementó la actividad de unión de NF-B al DNA en el hígado (determinada mediante análisis por EMSA) y provocó un incremento de la expresión de los genes -glutamilcisteina sintetasa subunidad catalitica(-GCSC), -glutamilcisteina sintetasa subunidad reguladora (-GCSM), ciclina D1, ciclina E y un descenso de la transcripción de p21. Mediante el ensayo de inmunoprecipitación de fragmentos de cromatina (ChIP assay) observamos que NF-B está directamente regulando la transcripcion de -GCSC , -GCSM y ciclina D1, a través de la unión de NF-B a sus respectivos promotores, que se produce en animales deficientes en vitamina E. Estos hallazgos sugieren que la deficiencia crónica de vitamina E induce importantes procesos moleculares relacionados con el daño celular hepático, con una alteración de la expresión de genes marcadores de estrés oxidativo y genes que controlan el ciclo celular y demuestran que NF-B está implicado en esta respuesta. Los resultados obtenidos enfatizan la importancia de mantener un adecuado consumo de vitamina E, no sólo para prevenir el daño oxidativo hepático sino también para modular la correcta transducción de señales. ____________________________________________________________________________________________________, Vitamin E is an essential antioxidant nutrient that is receiving considerable public attention. Interest in vitamin E is high because new scientific data suggest optimal intake can help delay or prevent the onset of cancer, atherosclerosis, cataracts and other major diseases. Such degenerative diseases have been linked to damage from free radicals originated in body processes of oxidative stress. The redox-sensitive transcription factor Nuclear Factor-kappaB (NF-B) has been implicated as mediator in process of liver injury induced by oxidative stress. The purpose of this study was to determinate liver DNA-binding activity of NF-B and the response of target redox-sensitive genes and cell-cycle modulators in an in vivo model of oxidative stress induced by chronic vitamin E deficiency. Rats were fed either control diet or vitamin E free diet until 60 or 90 days after birth. Liver from 90 days vitamin E-deficient rats and isolated liver mitochondria from 60 or 90 days vitamin E deficient rats showed an increase in malondialdehyde (MDA) levels and a decrease in glutathione (GSH) concentration when compared with values found in its respective control rats. Vitamin E deficiency enhanced liver DNA-binding activity of NF-B (EMSA analysis) and up-regulated gamma-glutamylcysteine synthetase ( GCSC; GCSM), cyclin D1 and cyclin E. We also showed down-regulation of p21(Waf1/Cip1) transcription. Moreover, chromatin inmunoprecipitation (ChIP) assay demosntrated that NF-B directly regulates transcription of GCS (both subunits) and cyclin D1 through the binding of NF-B to the corresponding gene promotors, which was enhanced in vitamin E-deficiency. These findings show that vitamin E-deficiency induces significant molecular events related to liver cell damage with altered expression of either gene markers of oxidative stress and genes that control the cell cycle and demonstrate that liver NF-B is envolved in this response. Our results emphasize the importance of maintaining an adequate vitamin E consumption not only to prevent liver oxidative damage but also in modulating signal transduction.
Proyecto:


Reactividad de las arterias corionicas frente a factores vasoactivos derivados del endotelio

  • Aliaga Parreño, Regina
RESUMEN Se plantea como objetivo investigar las respuestas motoras de las arterias coriales frente a estímulos vasoconstrictores y vasodilatadores (especialmente aquellos relacionados con el endotelio), para contribuir al mejor conocimiento de los mecanismos de control de la circulación feto-placentaria en concreto: Estudiar el efecto y mecanismo de acción de ET-1(endotelina); Comparar los efectos de distintos vasodilatadores, atendiendo principalmente a su dependencia del endotelio y al agente vasoconstrictor inductor del tono activo; Correlacionar los datos clínico-obstétrico con las respuestas vasomotoras de las arterias coriales humanas. Las arterias, ramas terciarias coriales, son segmentos de 1x4mm. Los segmentos arteriales dispuestos en un baño de órganos, están conectados a un transductor de tensión isométrica. Se establece una tensión basal previa de 2g. En la respuesta contráctil, estudiamos el comportamiento arterial a ET-1. Realizándose curvas concentraciónrespuesta de ET-1 (10-11-10-7M), en situación control y:1)Para determinar el tipo de receptor predominante, ETA o ETB, obtuvimos curvas concentración-respuesta de ET-1 (10-11-10-7M) y ET-3 (10-10-10-6M), analizando la potencia relativa entre ambos agonistas.2)Para estudiar la posible participación del NO (óxido nítrico) en la respuesta, obtuvimos curvas concentración-respuesta de ET-1 y ET-3 tras incubación arterial con el inhibidor de la síntesis de NO, L-NAME,(10- 4M).3)Para valorar el papel del Ca2+ en la respuesta, obtuvimos curvas concentración-respuesta de ET-1:a/en medio sin Ca2+ y en presencia de un quelante del Ca2+ (EGTA,10-3M);b/ previa incubación con , nicardipina (10-5M). En la respuesta relajante de las arterias coriales ensayamos sustancias vasodilatadoras que actúan mediante diferentes vías: endotelio-dependientes (ACh-acetilcolina-,10-9-10-4M), y endotelio-independientes: adenosina (10-8-10-4M), NPS-nitroprusiato sódico-(10-9-10-4M) y nicardipina (antagonista del Ca2+,10-10-10-4M). Tono activo con: ET-1 (10-7M), PGF2 prostaglandina-(10-5M). Para nicardipina además, KCl (50mM)]. Para determinar la influencia de factores obstétricos y neonatales sobre la respuesta corial, realizamos análisis estadísticos entre las semanas de gestación, horas de periodo activo de parto, horas desde parto hasta inicio experimento, peso de la placenta, peso del neonato y pH de arteria y vena umbilical, respecto de los valores de CE50 y Emáx obtenidos para todos los estímulos investigados. Resultados: Datos obstétricos-las variables cualitativas: sexo, vía finalización parto y tipo de anestesia, la distribución porcentual muestral es superponible a la distribución poblacional; las variables cuantitativas están en de los parámetros de normalidad exigidos en el estudio. Resultados sobre reactividad vascular: Los resultados sugieren la activación de los receptores ETA de las arterias, la ET-1 tiene mayor afinidad que ET-3 por estos receptores, el orden de potencia es 10 veces mayor para ET-1. La activación de los receptores para ET-1 activa la producción de NO. Este NO atenuaría la respuesta contráctil a ET-1, si se inhibe su síntesis, también sus efectos. La respuesta vasoconstrictora inducida por ET-3 no se ve modificada por L-NAME, esto demostraría que este mecanismo de retroalimentación negativa sólo opera para ET-1. La entrada de Ca+2 extracelular es esencial en la respuesta contráctil de las arterial coriales frente a ET-1. En los experimentos el 66% del Emáx (efecto máximo) a ET-1 depende de esta entrada. Las arterias coriales responden a estímulos relajantes, aunque la magnitud de la relajación dependerá del agente inductor de tono activo. Nuestros resultados objetivan una gran respuesta relajante arterial siguiendo la vía del NO. Los estudios de correlación: parámetros clínicos vs reactividad vascular, objetivaron cuatro funciones de regresión lineal estadísticamente significativas: correlaciónes positivas entre las semanas de gestación y el peso del neonato respecto del Emáx de ET-1 en medio sin Ca+2 y entre pCO2 en sangre de arteria umbilical vs Emáx de nicardipina en arterias precontraídas con PGF2a y Correlación negativa entre el peso del neonato vs Emáx de ET-1 en presencia de L-NAME. ____________________________________________________________________________________________________, Chorial vessels play an important role in the placental vascular resistence, however most of previus studies on placenta vascular reactivity it has be made in umbilical vessels. This study investigate the motor response of the chorial arteries to vasoconstrictor and vasodilator stimulis with the purpose of contributing to the best knowledge of the control mechanisms of the circulation fetus-placentaria: 1-. Studying the effect and mechanism of ET-1 (endothelin) action, 2-. Analyzing the effects of differents vasodilators, according to the inductive vasoconstrictor agent of the active tone and 3-. Making a correlation between the data clinical-obstetricians and the vasomotor responses of the chorial arteries. The chorial segments of 1x4mm were introduced in a bath of organs and they were connected to a transducer of isometric tension, the tension was settled down as 2 g. Then it was analyzed the vasoconstrictor response of chorial arteries to: - ET-1 and ET-3 at basal conditions and after incubation with inhibitor of the synthesis of NO -nitric oxide- (L-NAME), - ET-1 free Ca2+ medium and Ca2+ chelator medium. Beside we studied the vasodilator response with Ach (acetylcholine), NPS (sodic nitroprusiate) , adenosine and nicardipine.
Proyecto:


Epigenetic transcriptional repression of tumor suppresor genes and its reversion by drugs.

  • Villar Garea, Ana
Genetic alterations and deregulation of the epigenetic mechanisms collaborate in the initiation and progression of cancer. In contrast to the genetic defects, the epigenetic abnormalities are potentially reversible. This fact has driven the search for drugs that induce selectively changes in the epigenetic patterns of the tumor cells and thus lead to differentiation, cell death and/or cell growth arrest. Inhibitors of DNA (cytosine-5)-methyltransferases (DNMTs) and inhibitors of Zn(II)-dependent histone deacetylases (HDACs) have been developed with this purpose. The DNMTs inhibitors allow the reactivation of genes, including tumor-suppressor genes, silenced through hypermethylation of the CpG island at their promoter. The HDACs inhibitors allow the reexpression of genes silenced by ypoacetylation of the histones associated at their promoters. Despite all these chemicals have promising effects on cultured cancer cells, many of them have side-effects that limit their use in anticancer chemotherapy. Because of that, we analyzed the properties of the anesthetic procaine (4-aminobenzoic acid 2-diethylaminoethyl ester) as a new inducer of DNA demethylation and we also compared the effects of seven HDACs inhibitors. In both cases, the breast cancer cell line MCF7 was the model system. 1. Procaine reduces the proportion of 5-methylcytosine into global genomic DNA, achieving its maximum effect within 24-48 h of treatment. Low concentrations of procaine decrease the amount of 5- methylcytosine at RAR¦Â2 promoter, which is hypermethylated in MCF7 cells, and reactivate its expression with only small decrease in global DNA methylation. This fact could be an advantage, since global DNA hypomethylation leads to chromosomal instability. Finally, procaine reduces cell proliferation and arrests cell cycle in mitosis, but does not induce apoptosis in MCF7 cells after treatments 3 days long. 2. The seven inhibitors of Zn(II)-dependent HDACs chosen for comparison were: two carboxylic acids (butanoic and valproic acid); one N-(2¡¯-aminophenyl) benzamide (MS-275); and four hydroxamic acids(trichostatin A, suberoylanilide hydroxamic acid, CX and CY). The results of in vitro HDAC activity assays performed on MCF7 nuclear extracts show the existence of a relationship between the chemical structure of these compounds and their activity: low micromolar concentrations of hydroxamic acids are sufficient for inhibiting almost completely the deacetylase activity, whereas millimolar concentrations of carboxylic acids are required for similar effects. Also the alterations that the drugs cause on cell growth and cell cycle arrest depend on its chemical structure. The IC50 for cell treatments 24 h long is in the range of millimolar concentrations for butanoic and valproic acids and low micromolar for the rest of the chemicals. At the IC50, MS-275 induces cell growth arrest in G1/G0, whereas the hydroxamic acids stop cell cycle mostly at G2/M and the carboxylic acids seems to arrest the cycle at both G1/G0 and G2/M. Despite all these inhibitors induce similar changes in the global acetylation of H4 and H3 when employed at their respective IC50, not all of them are able of reactivate the expression of the same genes. Moreover, it seems that the induced expression levels of CDKN1A and GADD45¦Â determine the alterations induced by the drugs on cell cycle. The changes on histone modifications at the promoters of six genes ( CDKN1A, GADD45¦Â, JunD, IGFBP3, MT1X and MT2A) upon CY treatment were studied. HDACs inhibition induces an increase in histone H4 tetraacetylation and in dimethylation of lysine 4 in H3, as well as a decrease in dimethylation of lysine 9 in H3. Additionally, HDAC2 is released from the promoters upon CY treatment. These changes take place also in the promoters of MT1X and MT2A, the genes whose expression remains unaltered after the treatment with CY. __________________________________________________________________________________________________ RESUMEN Las alteraciones gen¨¦ticas y la desregulaci¨®n de los mecanismos epigen¨¦ticos colaboran en la iniciaci¨®n y progresi¨®n del c¨¢ncer. Los defectos epigen¨¦ticos son potencialmente reversibles, lo que ha suscitado la b¨²squeda de f¨¢rmacos que selectivamente causen cambios en los patrones epigen¨¦ticos de las c¨¦lulas tumorales, con la consiguiente diferenciaci¨®n, muerte y/o parada de crecimiento de las mismas. Se han estudiado especialmente inhibidores de metiltransferasas de DNA (DNMTs) e inhibidores de desacetilasas de histonas (HDACs) dependientes de Zn(II). Los inhibidores de DNMTs posibilitan la reactivaci¨®n de genes silenciados mediante hipermetilaci¨®n de la isla CpG de su promotor y los inhibidores de HDACs, de genes silenciados v¨ªa hipoacetilaci¨®n de las histonas asociadas a su promotor. A pesar de sus prometedores efectos en cultivos celulares, muchas de estas sustancias presentan inconvenientes que limitan su aplicaci¨®n en quimioterapia. Por ello, en esta tesis: 1. Se ha estudiado por primera vez la capacidad del anest¨¦sico proca¨ªna para reducir la metilaci¨®n de DNA gen¨®mico y la proliferaci¨®n de la l¨ªnea celular MCF7. Proca¨ªna reduce la cantidad de 5-metilcitosina en DNA, reactiva genes silenciados por hipermetilaci¨®n ( RAR¦Â2) e induce parada del ciclo celular en mitosis. 2. Se han comparado siete inhibidores de HDACs dependientes de Zn(II): ¨¢cido butanoico, ¨¢cido valproico, MS-275, tricostatina A (TSA), SAHA, CX y CY. Existe una relaci¨®n estructura-actividad para los efectos de estas sustancias en ensayos in vitro y en el crecimiento de MCF7. Adem¨¢s, aunque estos inhibidores inducen cambios similares en acetilaci¨®n global de histonas, no todos reactivan los mismos genes. Los niveles expresi¨®n de CDKN1A y GADD45¦Â parecen determinar los efectos de estos compuestos en el ciclo celular. En los promotores de los seis genes estudiados, la inhibici¨®n de HDACs aumenta la acetilaci¨®n de H4 y la dimetilaci¨®n de la lisina 4 de H3, mientras disminuye la dimetilaci¨®n de lisina 9 de H3.
Proyecto:


Factores predictores de infección nosocomial en el ictus agudo. Influencia de la infección en la morbimortalidad.

  • Ros Mora, María Lourdes
RESUMEN Fundamento y Objetivo: El ictus constituye una causa importante de mortalidad y discapacidad. El objetivo del presente estudio es identificar los factores predictores de infección nosocomial en la fase aguda del ictus y como ésta influye en la morbimortalidad de esta enfermedad. Pacientes y Métodos: Estudio prospectivo observacional longitudinal de cohortes de pacientes con ictus agudo. El ictus se diagnosticó según la definición dada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) y actualizada por la Sociedad Española de Neurología (SEN). La infección nosocomial se definió por los criterios de los Center for Disease Control (CDC) y los de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). Resultados: Se incluyó a 258 pacientes con ictus agudo. De éstos, 102 (39,5%) presentaron al menos, una infección nosocomial (45,5% M; edad X 78,2 DE 9,7). La estancia media hospitalaria fue significativamente mayor en los pacientes infectados 14,9 días (8,4) que en los no infectados 8,4 días (5,6) (p<0,001). 31 pacientes fallecieron, de los que 22 (71%) habían tenido al menos una infección. Al realizar análisis de regresión logística se observó que la alteración en la deglución (OR 12,7; IC 95% 5,3-30,1; p<0,001), la afectación motora crural (OR 4,5; IC 95% 1,7-12,3; p=0,003), la alteración del esfínter urinario (OR 2,9; IC 95% 1,3-6,4; p=0,009) y la diabetes mellitus (OR 2,3; IC 95% 1,1-4,7; p=0,03), se comportan como factores predictores independientes que aumentan la probabilidad de infección nosocomial en el ictus agudo. La escala de NIHSS >20 en el momento del ingreso (OR 17,3; IC 95% 5,1-59,5; p<0,001), el efecto masa diagnosticado en la TAC (OR 4,4; IC 95% 1,4-14; p=0,012), el empeoramiento neurológico durante las primeras 24 horas (OR 11,6; IC 95% 3,6-37,2; p<0,001), la infección respiratoria (OR 5,7; IC 95% 1,8-18,3; p=0,003) y la hiperglucemia a la admisión (OR 6; IC 95% 1,5-25,6; p=0,015) son factores predictores independientes que aumentan la probabilidad de muerte en el ictus agudo. La escala de NIHSS>20 (OR 8,9; IC 95% 2,7-29; p<0,001), el empeoramiento neurológico durante las primeras 24 horas (OR 8,1; IC 95% 2,2-29,6%; p=0,002) y la alteración del control del esfínter urinario (OR 10,1; IC 95% 5-20,6; p<0,001) son factores predictores independientes del aumento de probabilidad de peor estado funcional al alta. Conclusiones: La disfagia, la afectación motora crural, la incontinencia urinaria y la diabetes mellitus, son las variables clínicas que se identifican como factores de riesgo independientes para la infección nosocomial en la fase aguda del ictus. Esta complicación médica, sobre todo la infección respiratoria, aumenta significativamente la probabilidad de muerte de esta enfermedad. __________________________________________________________________________________________________, Background and Purpose: stroke is a very important cause of mortality and disability. This study has the objective to identify predictors factors and the clinical consequences of nosocomial infection in acute stroke. Patients and Methods: we prospectively identified a consecutive cohort of patients who we either admitted after an acute stroke. We used predefined diagnostic criteria by OMS and SEN for stroke and by CDC and SEIMC for infection. Results: 258 patients with acute stroke were included. 102 (39,5%) had at least one nosocomial infection (45,5% M; edad X 78,2 DE 9,7). The mean hospital stay was 14,9 days (8,4) in infection patients and 8,4 days (5,6) in no infection patients (p<0,001). 31 patients died and 22 (71%) had at least one cause of infection. Using logistic regression analysis, the dysphagia (OR 12,7; IC 95% 5,3-30,1; p<0,001) is the strongest and independient predictor of nosocomial infection. Others factors are crural motor affectation (OR 4,5; IC 95% 1,7-12,3; p=0,003), urinary incontinence (OR 2,9; IC 95% 1,3-6,4; p=0,009) and diabetes mellitus (OR 2,3; IC 95% 1,1-4,7; p=0,03). Baseline imbalance NIHSS >20 during the admission (OR 17,3; IC 95% 5,1- 59,5; p<0,001), mas effect diagnosticated on TAC (OR 4,4; IC 95% 1,4-14; p=0,012), poor outcome neurological during the first day (OR 11,6; IC 95% 3,6-37,2; p<0,001), chest infection (OR 5,7; IC 95% 1,8-18,3; p=0,003) and the hyperglucemia in admission (OR 6; IC 95% 1,5- 25,6; p=0,015), are the independients predictors factors that increasing the likelihood for mortality in acute stroke. Baseline imbalance NIHSS >20 (OR 8,9; IC 95% 2,7-29; p<0,001), poor outcome neurological during the first day (OR 8,1; IC 95% 2,2-29,6%; p=0,002) and the urinary incontinence (OR 10,1; IC 95% 5-20,6; p<0,001) are the independients predictors factors that increasing the likelihood of poor functional state in discharge. Conclusions: dysphagia, crural motor affectation, urinary incontinence and diabetes mellitus are the independients predictors factors that increasing the likelihood for nosocomial infection in acute stroke. The chest infection increase significantly the likelihood of mortality during the hospital stay.
Proyecto:


Obtención y caracterización de mutantes funcionales del gen frataxin homologue (FH) en Drosophila.

  • Navarro Langa, Juan Antonio
RESUMEN La ataxia de Friedreich es una enfermedad humana neurodegenerativa y de herencia autonómica recesiva. Es la ataxia hereditaria más común en la población caucásica. La enfermedad está causada por la deficiencia de la proteína frataxina. Las claves sobre la función de la frataxina provienen de los diferentes estudios llevados a cabo en varios organismos modelo. Se han aislado los genes ortólogos en un número elevado de organismos desde bacterias al ratón y también en plantas. En nuestro laboratorio se ha aislado el gen de Drosophila que codifica para la proteína frataxina, el gen fh. Drosophila ha resultado ser un excelente modelo para el estudio de enfermedades humanas dado que son muchos los procesos biológicos conservados entre la mosca y el hombre, como por ejemplo, la formación y degeneración del sistema nervioso, la generación y función del corazón, el metabolismo mitocondrial, etcEn este trabajo se ha abordado el estudio de la función del gen fh en D. melanogaster empleando tres de las múltiples estrategias existentes en este organismo orientadas a la obtención de fenotipos mutantes: la movilización de elementos transponibles P, el sistema ARNi y la sobreexpresión. Con los experimentos de mutagénesis insercional no se obtuvieron los resultados esperados debido a que el gen fh es un gen pequeño localizado en una región rica en genes y flanqueado por dos e incluso tres puntos calientes de inserción. Se abordó entonces una segunda aproximación consistente en el uso del sistema UASGAL4 para el desarrollo de experimentos de sobreexpresión e interferencia. La interferencia o la sobreexpresión del gen fh en los tejidos de Drosophila equivalentes a aquellos afectados en los pacientes (sistema nervioso periférico, músculo y corazón) y en el desarrollo embrionario de Drosophila, inducen la aparición de letalidad, de alguna alteración fenotípica o de alguna modificación del comportamiento. Los defectos encontrados se concentran por una parte en el SNP, tanto en las neuronas y axones del comportamiento sensorial, como en los axones motores embrionarios. En esta caso las neuronas motoras no parecen afectadas, aunque la sobreexpresión y la intereferencia en estas estructuras si que han inducido defectos en el adulto. Por otra parte, se han observado alteraciones importantes en varios de los derivados del mesodermo embrionario, como son el músculo somático y las células cardiacas y pericardiacas. Todos estos defectos conducen a la aparición de 100% de letalidad antes de la emersión del adulto o a una disminución de la capacidad de supervivencia y escalada en los casos en los que se obtiene descendencia. La interferencia y la sobreexpresión en el músculo sólo han resultado efectivas si la alteración se produce en los primeros momentos del desarrollo de las estructuras afectadas. Por su parte, en el SNP sólo se han producido daños cuando se han afectado conjuntos de precursores sensoriales o de neuronas sensoriales recién diferenciadas, que participan en la formación de los órganos sensoriales en el embrión y en el adulto. Pero al parecer, la función de fh no es igual de importante en todos los órganos sensoriales, ya que la modificación de su expresión en los órganos cordotonales no parece producir ningún efecto significativo, aunque es posible que sea debido a que las funciones que desarrollan también son realizadas por las neuronas multidendríticas. Todos los resultados descritos permiten establecer un modelo, en D. melanogaster, para el estudio de la ataxia de Friedreich. __________________________________________________________________________________________________, Friedreich ataxia is a severe autosomal recessive disease characterized by neurodegeneration, cardiomyopathy, and diabetes, resulting from reduced synthesis of the mitochondrial protein frataxin. It is the most common ataxia among the caucasian population. The research developed in in patient cells and model organisms such as yeast, worm, fruitfly and mouse have suggested several hypotheses on the frataxin function, but the full physiology of frataxin in mitochondria has not been well established yet. In our laboratory, the Drosophila frataxin gene (fh) was isolated. Very recently Drosophila has become an excellen model to study human diseases given that humans and flies have in common the most important biological processes, for example development and degeneration of nervous system, heart development, mitochondrial metabolic pathways, etc... In this work, we have carried out the study of the Drosophila frataxin function using three strategies: insertional P element mutagenesis, RNAi system and overexpression. The insertional mutagenesis was unsuccessful because fh is a small gene that lies in a crowed genomic region and is surrounded by two and even three insertional hotspots. Then we began to use a second approach based on the generation of transgenic flies overexpressing and reducing the Drosophila frataxin homolog gene by means of the UAS-GAL4 system. Full lethality, phenotypic alterations or misbehaviours (climbing deficits and shortened life span) were achieved when this gene was overexpressed or knocked down in a general or mesodermal patterns and in the PNS (the most affected tissues in the patients) due to the appearance of developmental defects in muscle, heart and nervous system. Our results showed that both an excess or a reduction of frataxin expression disturb development of muscular and nervous systems in Drosophila. As in humans, the damages are mainly focused on the Drosophila peripheral nervous elements (sensory and motor axons and neurons). Moreover, important defects have also been observed in mesodermic derivates such as somatic muscles, cardial and pericardial cells. However, the defects have only been provoked when the misexpression was carried out in the earlier stages of muscle and nervous system development. All these data together suggest that D. melanogaster could be an appropiate model organism to study Friedreich ataxia.
Proyecto:


Introducción de la tecnología de transferencia génica en lubina (Dicentrarchus labrax)

  • Muñoz Forcada, Iciar
RESUMEN Este trabajo abarca distintos aspectos de la metodología de la transferencia génica en lubina, tanto in vitro como in vivo. Por una parte, se ha centrado en el estudio y evaluación de la transferencia génica somática como posible sustitución a la transgénesis estable en distintas aplicaciones. Por otra parte, se ha evaluado el sistema de regulación por tetraciclina para la regulación exógena de genes en peces. Por último, se ha probado que una línea celular de lubina puede utilizarse como sistema de expresión de genes exógenos. Por primera vez se demuestra que la inyección de DNA plasmídico es eficiente para transferir genes exógenos a músculo de lubina. Los factores que favorecen la expresión son, dosis altas de plásmido, el uso de un promotor adecuado, y un estado metabolicamente activo del músculo. La expresión que se obtiene es transitoria, alcanzándose el máximo cinco días después de la inyección. Una limitación de esta técnica es la incapacidad de reproducir en los distintos individuos inyectados, la manera exacta en que la aguja de inyección entra en el paquete muscular, lo que origina una gran variabilidad en cuanto a la toma de DNA por parte de las células, y por tanto en el nivel de expresión del transgen. Esto se puede mejorar aumentando el número de animales inyectados para disminuir así el error debido a la técnica, o usando una segunda construcción para normalizar la transfección. La técnica de inyección de DNA en músculo se ha ensayado como método de vacunación en peces. Sin embargo, ésta es la primera vez, que se prueba esta técnica en peces para secretar una hormona en sangre. Como gen a inyectar se ha diseñado y construido un gen híbrido que codifica una hormona gonadotropa de cadena única de lubina. Tras su inyección en músculo de lubina se pudo detectar la proteína en plasma. Para sistemas de origen piscícola, no se dispone hasta el momento de un método que permita controlar la expresión de genes exógenos de manera fiable. Por primera vez, hemos probado la utilidad del sistema de regulación por tetraciclina para esta misión. Tras valorar diferentes versiones del sistema en células de pez in vitro y en músculo in vivo, podemos concluir que la opción más eficiente es el uso del transactivador tTA bajo el control de un promotor estable. Al igual que en células de mamíferos, hemos comprobado que las células de pez también presentan dificultades para mantener el sistema de regulación por tetraciclina de una manera funcional; como resultado, encontrar clones con un grado de regulación óptimo y un nivel bajo de expresión basal es difícil. Sin embargo, el uso de una estrategia basada en el uso del plásmido nuevo pTet-luc+-pur/GFP facilita esta tarea, y permite obtener un alto porcentaje de clones regulables. A lo largo de este trabajo se han comparado los promotores CMV, de origen viral, y el promotor de la actina ß de carpa, para dirigir la expresión de distintos genes tanto en las líneas celulares EPC y SBL, como en músculo de lubina in vivo. Los resultados nos permite concluir que el promotor de la actina ß de carpa, es más débil en cuanto al nivel de expresión génica que logra promover, y menos estable a la hora de mantenerse en una línea celular que el promotor CMV. Por último, los resultados obtenidos con la línea celular SBL permiten señalar a esta línea como un sistema de lubina apto para la expresión de genes exógenos. Estas células son capaces de secretar los productos de los genes introducidos, con lo que podrían ser utilizadas para la producción de proteínas recombinantes. __________________________________________________________________________________________________, This work focuses on different aspects of the gene transfer methodology in sea bass. On one hand, the use of the somatic gene transfer has been evaluated as an alternative to the use of stable transgenesis in different applications. Somatic gene transfer has been used as method of delivery of a recombinant single-chain gonadotropin into the blood stream in sea bass. On the other hand, we have evaluated the use of the tetracycline regulated system to control exogenous gene expression in fish. The results showed that the best choice was the use of the rtTA transactivator under the control of a stable promoter. Finally, a sea bass cell line has proven to be an efficient system for the expression of exogenous gene.
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Estrés oxidativo y expresión de proteínas relacionadas en enfermedades de alto riesgo cardiovascular: estudio especial de la hipertensión arterial

  • Espinosa Ibáñez, Olga
RESUMEN Entre las múltiples y variadas implicaciones fisiopatológicas del Estrés Oxidativo, los trastornos cardiovasculares son, sin duda, uno de los objetivos prioritarios y motivo de interés de un gran número de investigadores biomédicos. Uno de los principales factores de riesgo es el desarrollo de una serie de enfermedades frecuentes en nuestra población como son la hipertensión arterial y las dislipemias. Éstos trastornos, tienen una vinculación más o menos estrecha, directa o indirecta con el fenómeno que conocemos como estrés oxidativo y los 3 tipos de patologías poseen aumentados los niveles de EO de manera que se potencia el riesgo de aparición de eventos cardiovasculares. Objetivo de este estudio es comparar los niveles de EO en las diferentes patologías cardiovasculares seleccionadas (HTA con y sin Síndrome Metabólico asociado, HF y HFC) midiendo la respuesta de las células mononucleares frente al EO crónico a través de la medida de los niveles de ARNm de las actividades antioxidantes en cada una de ellas. Dicho estudio comparativo se va a realizar mediante el análisis de los siguientes parámetros oxidativos en orina, plasma y en células circulantes de los grupos seleccionados y el grupo control: 1.- Estudio de los productos de oxidación, marcadores de EO y metabolitos relacionados (GSH, GSSG, 8-oxo-dG nuclear, mitocondrial y urinaria, MDA, proteínas carboniladas y niveles de NO3/NO2 . 2.- Determinación de la actividad de los principales sistemas antioxidantes y prooxidante (SOD Cu-Zn y Mn, Cat, GPx, GSR y XO) . 3.- Cuantificación de los niveles de ARNm por RT-PCR cuantitativo a tiempo real, de los genes que codifican dichas actividades enzimáticas, además de OGG1 y G6PDH. CONCLUSIONES 1) En las tres patologías, HTA, HF y HFC, los resultados obtenidos sugieren que el EO representa un mecanismo común y subyacente en la patogenicidad de dichos procesos y posiblemente contribuya al desarrollo de complicaciones cardiovasculares, si bien, el mecanismo bioquímico-molecular responsable del proceso oxidativo presenta características diferenciales entre ellas, así como la intensidad de respuesta al EO. 2) Los niveles elevados de EO en estas patologías no dependen exclusivamente de un aumento en su producción ya que existe una menor actividad antioxidante. La disminución de los mecanismos antioxidantes se debe principalmente a: - Actividad reducida de los genes antioxidantes y del sistema GSH. - Menores niveles de ARNm, disminuyendo así su capacidad de producir enzimas y sistemas protectores frente a EO. 3) Los pacientes de HTA sin tratamiento se encuentran peor protegidos frente a EO que los controles, a pesar de la activación de algunos sistemas antioxidantes como el sistema Tiorredoxina y la enzima Manganeso Superóxido Dismutasa. 4) Los pacientes de HTA con y sin síndrome metabólico asociado no presentan diferencias significativas entre sí, lo que nos confirma que es la HTA el factor asociado al estrés oxidativo, siendo indiferentes las otras características que determinan el diagnóstico de síndrome metabólico. 6) La hipertensión arterial progresa con una marcada oxidación del material genético que se verifica por el aumento en la producción de la base modificada y mutagénica 8-oxo-dG como resultado del estrés oxidativo y de la disminución de enzima reparadora OGG1 en las células mononucleares de los pacientes hipertensos. 7) De los marcadores analizados, la liberación de 8-oxo-dG en orina es el parámetro más representativo del estrés oxidativo en la hipertensión arterial. 8) Los tres modelos de EO crónico analizados poseen un aumento en los niveles de EO pero distinta intensidad en su respuesta. Los pacientes se encuentran desprotegidos frente al EO. __________________________________________________________________________________________________, The main aim of this study is to compare the EO levels in some different cardiovascular diseases, previously selected (control, HTA with and without an associate metabolic syndrome, HF and HFC), by measuring the response of mononuclear cells against the chronicle EO through the RNAm level in the antioxidant activity of each one. This comparative study is carried out in different groups by the analyse of different oxidative parameters in urine, plasma and circulated cells. 1.- Study of oxidation products , EO markers and related metabolites. 2.- Main antioxidant and prooxidant systems activity determination. 3.- RNAm level quantification by a real time quantitative RT-PCR. CONCLUSIONS: 1.- The results of the three pathologies (HTA, HF and HFC) propose that EO represents a common and underlying mechanism in their pathologies process and probably it contributes to develop cardiovascular complications, although the responsible biochemistry-molecular mechanism of the oxidative process shows many different features between them. 2.- The high levels of EO in these pathologies do not exclusively depends on an increase of its production because the oxidant activity is lower. 3.- HTA patients without a treatment are worse protected against EO that the controled ones, despite of the activation of some antioxidant systems like Tiorredoxine System and SOD Mn enzyme. 4.- HTA patients with and without the associated metabolic syndrome do not show great differences between them, so it confirms that HTA is the associated factor to the oxidative stress. 5.- The High blood pressure progresses with a high oxidation of the genetic material, that it is verified by the increase of the production of modify base and mutagenig 8- oxo-dG as a result of oxidative stress and the decrease of repairing enzyme OGG1 in the mononuclear cells. 6.- In analysed markers, the 8-oxo-dG liberation in urine is the most representative parameter of oxidative stress in high blood pressure. 7.- The three EO chronicle models analysed have an increase on EO level but different intensity in their response so patients are unprotected against EO.
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Estabilidad del mRNA de rbcL en el cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii: Papel de la 5' UTR

  • Suay Llopis, María Loreto
RESUMEN La longevidad de los transcritos del gen cloroplástico rbcL en Chlamydomonas reinhardtii depende de la presencia de una corta secuencia de 10 nucleótidos localizada en el extremo 5´ del mRNA. Este elemento de secuencia forma parte de una estructura secundaria que, probablemente, también es importante para la estabilidad de los transcritos de rbcL. Utilizando genes quiméricos constituidos por modificaciones de la 5´UTR de rbcL y la secuencia codificante del gen uidA, como gen reportero, e introduciéndolos en el cloroplasto de C. reinhardtii se ha podido determinar los requisitos de secuencia y de conformación esenciales para la estabilidad de estos transcritos. Los cambios realizados afectan a la secuencia del extremo 5´, a su estructura secundaria o a ambos. Cambios de la secuencia de la estructura secundaria localizada en el extremo 5´ (p.e. haciendo mayor o menor el stem o la horquilla) no tienen efecto en la vida media de los transcritos siempre y cuando mantengan la secuencia y la conformación de la base de la misma que afecta al elemento de estabilidad. En cambio, cualquier cambio nucleotídico que altere la conformación del elemento de estabilidad produce la rápida degradación de los transcritos. La conformación del elemento de estabilidad debe de contener los cuatro primeros nucleótidos, desde +38 hasta +41, en doble cadena, formando la base de la primera estructura secundaria. Las posiciones centrales, +42 (C), +43 (C) y +44 (G), deben de quedar en simple cadena mientras que las posiciones 3 del elemento, +45, +46 y +47, quedan en doble cadena, formando parte de la base de la segunda horquilla. Los resultados sugieren que, para que el elemento de estabilidad sea funcional sus 10 nucleótidos deben de quedar plegados en esta conformación. En C. reinhardtii se han descrito interacciones entre elementos cis, localizados en la 5´UTR de mRNA específicos cloroplásticos, y proteínas citosólicas que median de manera específica la estabilidad de estos mensajeros. Los mecanismos moleculares responsables del control de la estabilidad de los mRNAs cloroplásticos, aunque no se conocen en detalle, parecen basarse en estas interacciones. Los requisitos de secuencia y conformación de la 5´UTR de rbcL sugieren que la vida media de estos transcritos depende de la asociación del elemento de estabilidad con elementos trans que protegen el transcrito del ataque de las ribonucleasas y, de este modo, modulan su longevidad. Hasta el momento, no se ha descrito ninguna proteína implicada en el control de la estabilidad de este mensajero. Con objeto de identificar proteínas de unión a esta región se planteó una aproximación bioquímica in vivo de búsqueda global de proteínas de unión a un transcrito quimérico gobernado por la 5´UTR de rbcL. Se irradiaron con luz ultravioleta células vivas de C. reinhardtii, fijando así las interacciones directas entre el RNA y las proteínas que en ese momento del ciclo celular estén unidas al RNA quimérico in vivo. Los aductos RNA-proteínas obtenidos tras la irradiación se observaron como una banda retardada. Las proteínas asociadas se analizaron por espectrometría de MS/MS. De entre las proteínas identificadas en la banda de retardo en gel destacan la proteína disulfuro isomerasa (PDI) y la proteína de unión a RNA (RB38). Se ha corroborado in vitro la unión de éstas a la 5UTR de rbcL. Estos resultados se ven apoyados tanto por la función de estas proteínas como por el hecho de que se han descrito formando parte de un complejo proteico con capacidad de unión a la 5UTR del mRNA de psbA. Estas proteínas resultan prometedoras ya que, a través de ellas, se pueden diseñar nuevas aproximaciones que permitan acotar la búsqueda de las proteínas de unión específicas. __________________________________________________________________________________________________, RNA secondary structures, e.g. stemloops that are often found at the 5 and 3 ends of mRNAs, are in many cases known to be crucial for transcript stability but their role in prolonging the lifetime of transcripts remains elusive. In this study we show for an essential RNA-stabilizing stemloop at the 5 end of rbcL gene transcripts in Chlamydomonas reinhardtii that it neither prevents ribonucleases from binding to the RNA nor impedes their movement along the RNA strand. The stemloop has a formative function in which it mediates folding of a short 10 nucleotides sequence around its base into a specific RNA conformation, consisting of a helical and single stranded region, i.e. the real structure required for longevity of rbcL transcripts in chloroplasts. Disturbing this structure renders transcripts completely unstable, even if the sequence of this element is not altered. The requirement of a specific 5 sequence and structure for RNA longevity suggests an interaction of this element with a trans-acting factor that protects transcripts from rapid degradation in chloroplasts. At the moment, no protein has been described with specific affinity for this region. We have planned a biochemistry in vivo approach in order to look for proteins able to bind to a chimeric RNA headed by the 5UTR of rbcL messenger. Alive cells of C. reinhardtii were irradiated with UV light and the RNA-proteins aducts were purified. The associated proteins were analyzed by MS/MS spectroscopy. Among the identified proteins, PDI and RB38 could be pointed proteins because, both of them, has been described in a ribonucleoprotein complex with affinity by the 5UTR of the psbA chloroplast messenger. We have corroborated the in vitro affinity of both proteins, in an independent way, to the 5 UTR of rbcL. These proteins could be promising because, through them, we can propose new approaches to determine the specific protein involved in the regulation of the rbcL mRNA stability.
Proyecto:


Efectos electrofisiológicos miocárdicos intrínsecos producidos por la inhibición del sistema de intercambio sodio-potrón, en condiciones de normoxia, y tras la isquemia miocárdica regional. Estudio experimental.

  • Such Miquel, Luis
RESUMEN Hemos investigado: 1) los efectos protectores del intercambiador sodio-protón (NHE), con el 5-(N-etil-N-isopropil) amiloride (EIPA), a concentración 0.4 M, sobre la inducibilidad de la fibrilación ventricular (FV), y sobre la refractariedad miocárdica ventricular, tras la oclusión arterial coronaria; 2) los efectos electrofisiológicos intrínsecos producidos por la inhibición del NHE, administrando EIPA 0.4 y 1 M, en condiciones de normal oxigenación, sobre el automatismo sinusal, la conducción sinoauricular y auriculoventricular (AV), y sobre la refractariedad auricular, ventricular, y del sistema de conducción AV; y 3) los efectos electrofisiológicos miocárdicos intrínsecos producidos por la inhibición del NHE, con EIPA 0.4 y 1 M, sobre la frecuencia dominante (FD) de la FV inducida, en condiciones de normoxia, como característica electrofisiológica estrechamente relacionada con la refractariedad ventricular. Todos los experimentos se realizaron en corazón aislado y perfundido de conejo (preparación tipo Langendorff). Para conseguir el primer objetivo aplicamos el test del extraestímulo (TEE) ventricular con uno, dos, y tres extraestímulos, para tratar de inducir la FV. La aplicación del primer extraestímulo sirvió además para establecer el periodo refractario objeto de investigación. Las determinaciones se realizaron previamente y tras la oclusión arterial coronaria circunfleja, en dos grupos de experimentos: control y tratados con EIPA 0.4 M. Para cumplimentar el segundo objetivo analizamos: a) periodos refractarios efectivo y funcional auricular y del sistema de conducción AV mediante el TEE auricular, periodos refractarios efectivo y funcional ventricular mediante el TEE ventricular; b) automatismo sinusal mediante la determinación de la longitud del ciclo sinusal y del tiempo de recuperación del nodo sinusal; y c) tiempo de conducción sinoauricular con el test de Narula, conducción AV y conducción ventriculoauricular retrógrada, mediante la medición de la longitud del ciclo de Wenckebach y la longitud del ciclo de Wenckebach retrógrado respectivamente. Finalmente, para acometer el tercer objetivo analizamos, por el método de Welch, la FD media, máxima y mínima de la FV inducida por estimulación a frecuencias crecientes. Los parámetros citados se estudiaron en situación control e inhibiendo el NHE, con EIPA. Utilizamos dos concentraciones de dicho inhibidor: 0.4 y 1 M; la primera se halla en el rango de la IC50 para el NHE y la segunda es la concentración más comúnmente usada en los estudios de protección miocárdica. La inhibición del NHE con EIPA 0.4 M protegió al miocardio isquémico, al dificultar la inducibilidad de la FV. Este efecto protector, probablemente está relacionado, al menos en parte, con el mantenimiento de la refractariedad ventricular en el miocardio isquémico, lo cual ha sido también observado en el presente trabajo. Excepto para el caso del periodo refractario efectivo del sistema de conducción AV, que aumentó ligeramente con EIPA 1 M, la inhibición del NHE con EIPA 0.4 y 1 M en condiciones de normal oxigenación, no modificó la refractariedad intrínseca ventricular, auricular, ni del sistema de conducción AV, así como tampoco la FD de la FV inducida, mientras que deprimió ligeramente el cronotropismo sinusal y la conducción AV, si bien estos últimos podrían ser efectos secundarios, relacionados con la capacidad depresora del automatismo sinusal y la conducción AV que ejerce el amiloride, precursor del EIPA. El hecho de que la inhibición del NHE, manifestara efectos electrofisiológicos antiarrítmicos intrínsecos sobre el miocardio isquémico, impidiendo la caída de la refractariedad, y no ejerciera ninguna modificación electrofisiológica, en condiciones de normal oxigenación, sobre la refractariedad y la FD de la FV, propiedades ligadas a la aparición de arritmias por reentrada, coincide con lo relatado por diversos investigadores acerca del escaso, sino nulo, papel del NHE en situación fisiológica y su importancia en circunstancias fisiopatológicas como la isquemia. __________________________________________________________________________________________________, We have investigated the protective effects of the sodium-proton exchanger (NHE) inhibition using 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) 0.4 M, on the incidence of induced ventricular fibrillation (VF), and on intrinsic ventricular refractoriness, after circumflex coronary artery occlusion. Experiments were performed on isolated rabbit heart. To induce VF extrastimulus test with one, two and three extrastimuli, was used; the first extrastimulus application also served to determine refractory periods. Parameters were determined previously and after coronary occlusion, in both control and EIPA 0.4 M treated groups. In order to investigate whether the NHE inhibition produces some myocardial intrinsic electrophysiological effect, we have also investigated using EIPA, 0.4 and 1 M, in normoxic condition: a) the sinus cycle length and sinus node recovery time, as an automatism index; b) the sinoatrial conduction (Narulas test), and atrioventricular (AV) and ventricleatrial conduction, by anterograde and retrograde Wenckebach cycle length determination respectively; c) atrial, ventricular, and AV conduction system, effective and functional refractory periods using the extrastimulus test; and d) mean, minimum and maximum dominant frequency (DF) of VF by the Welchs method, which are properties closely related with ventricular refractoriness. NHE inhibition with 0.4 M protected the ischemic myocardium, decreasing VF inducibility, at least in part, by the maintenance of ischemic myocardium refractoriness, observed in this study. No modification on refractoriness was observed, in normoxic conditions, except an AV conduction system effective refractory period increase, with EIPA 1 M. The DF of VF was either not modified. EIPA 0.4 and 1 M also slightly depressed sinus chronotropism and AV conduction.
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