BUSCADOR RECOLECTA

Esta tesis doctoral ha sido realizada dentro de los siguientes proyectos de investigación: AGL2003‐08977‐C03‐01, AGL2006‐13410‐C06‐01/GAN, AGL2007‐66874‐C04‐01/GAN, AGL2010‐22341‐C04‐01, y han sido financiados por la Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología (CICYT)., Los lentivirus de pequeños rumiantes (SRLV), que incluyen al virus
Visna/Maedi (VMV) y al de la artritis encefalitis caprina (CAEV), infectan ovejas y
cabras distribuidas por todo el mundo causando un cuadro multisistémico que afecta
articulaciones, pulmones, glándula mamaria y sistema nervioso central. Las pérdidas
derivadas de la infección van desde el aumento en la tasa de reposición, a un
descenso en las producciones animales o en el valor comercial del rebaño. Aunque la
enfermedad causada por los SRLV es de carácter lento y generalmente afecta a
pulmones y glándula mamaria en nuestro país, se han descrito brotes
epidemiológicos causantes de artritis y encefalitis en ovinos que afectan un gran
número de animales, causando pérdidas directas.
En la actualidad existen 5 genotipos descritos (A‐E) que presentan una alta
variabilidad genética y biológica. Los genotipos A y B a los que pertenecen las estirpes
clásicas de VMV y CAEV respectivamente, están distribuidos mundialmente, mientras
que los genotipos C y E están restringidos a zonas geográficas concretas.
En ausencia de tratamientos o vacunas totalmente protectoras, las medidas
de control se basan en la detección temprana de animales infectados y su posterior
eliminación del rebaño. Tras la infección, los animales infectados desarrollan una
respuesta de anticuerpos que, si bien no es capaz de eliminar el virus, es indicadora
de la infección. Así, empleando métodos de detección serológica podemos
diagnosticar la infección indirectamente. Los métodos más eficaces hasta el momento
son los ELISAs basados en proteínas recombinantes y péptidos sintéticos. Sin
embargo, los métodos disponibles en el comercio están diseñados teniendo en
cuenta una única estirpe viral, que sumado a la alta variabilidad antigénica de los
SRLV, hace que las medidas disponibles fallen a la hora de controlar todo el espectro
antigénico presente.
La organización genómica de los lentivirus está bastante conservada entre los
miembros del género. Así, a los genes estructurales gag, pol y env encargados de
codificar proteínas de la cápside, proteínas para la replicación del material genético e
integración y las proteínas de la envoltura, respectivamente, hay que sumarles los
accesorios vpr, rev y vif en el caso de los SRLV, todos ellos flanqueados por el
regulador de la transcripción viral, la región LTR.
En la patogénesis de las enfermedades lentivirales es esencial conocer las
interacciones entre el virus y el hospedador que determinan el tropismo y el
desarrollo de los síntomas. Los factores virales incluyen las proteínas de la envoltura,
encargadas de unirse al receptor celular y la región LTR encargada de regular la
actividad transcripcional. Los factores del hospedador son más diversos ya que
pueden incluir todo el fondo genético de una raza o una población determinada capaz
de restringir la replicación viral de manera efectiva. Uno de los pasos clave en el
establecimiento de la infección es la superación de las barreras de la inmunidad
innata, que reconocen directamente determinantes virales e inducen la eliminación
del patógeno mediante factores de restricción como APOBEC3.
La caracterización genética y virológica de las estirpes implicadas en los brotes
epidemiológicos de artritis y encefalitis, puede aportar hallazgos esenciales en el
conocimiento de la relación entre la secuencia genética de los aislados y la capacidad
para establecer la infección en un tejido determinado. Por otro lado, componentes de
la inmunidad innata del hospedador capaces de inhibir la replicación viral pueden ser
también determinantes del tropismo.
Por todo ello en esta tesis nos planteamos los siguientes estudios:
a) Aislamiento y caracterización genética de estirpes implicadas en el brote
artrítico.
b) Aislamiento y caracterización genética de estirpes implicadas en el brote de
encefalitis.
c) Caracterización de la restricción de los SRLV por APOBEC3., Small ruminant lentiviruses (SRLV) include Visna Maedi virus (VMV) and
caprine arthritis encephalitis virus (CAEV), infect sheep and goats and are widely
distributed around the world causing a multisistemic disease of carpal joints, lungs,
mammary gland and central nervous system. Losses derived from SRLV infection
range from increased reposition rates in affected flocks to decreased animal
production and low commercial value of the flock. SRLV‐induced disease is a slow
process that affects mainly lungs and mammary gland in sheep from Spain, however
new epidemiological outbreaks of arthritis and encephalitis in sheep have affected a
high number of animals causing direct losses.
Currently, 5 genotypes (A‐E) have been described showing a high genetic and
biological variability. Genotypes A and B include classic VMV and CAEV strains
respectively, and are widely distributed whereas genotypes C and E are
geographically restricted.
In the absence of treatments or protective vaccines, control measures are
based on early detection of infected animals and culling. After infection, animals
develop an antibody response unable to control viral replication, but indicative of
viral infection. Thus, through the application of serological methods infection can be
detected. The most currently used method is ELISA based on recombinant proteins
and/or synthetic peptides. However, available tools are designed on the basis of a
single strain that, together with the high variability present in SRLV hinder the
detection of the whole SRLV antigenic spectrum.
Lentiviral genomic organization is quite conserved among viruses within the
genus. Thus, structural genes gag, pol and env encode capsid proteins, proteins that
replicate and integrate viral genome and envelope proteins, respectively, plus
accessory genes vpr, rev and vif in the case of SRLV, all of them flanked by the LTR as
transcription regulator.
Host‐virus interactions are essential in the development of lentiviral‐induced
pathogenesis finally determining tropism and disease onset. Viral factors include Env
proteins that mediate binding with cellular receptor, and the LTR region due to its
control of transcriptional activity. Host factors may include all the genetic background
belonging to a specific breed or animal population able to restrict viral replication
efficiently. Transgression of innate immune barriers responsible for the direct
recognition and elimination of the pathogen, such as APOBEC3, is one of the key
steps to overcome in the establishment of infection.
Genetic and virological characterization of the strains involved in the arthritic
and encephalitic outbreaks may provide new insights in the association between
genetics and the ability to establish a tissue targeted infection. On the other hand,
innate immunity restriction factors, able to inhibit viral replication, are also
determinants of viral tropism.
Therefore in this Thesis the following studies were conducted:
a) Isolation and genetic characterization of SRLV strains involved in the arthritic
outbreak.
b) Isolation and genetic characterization of SRLV involved in the encephalitis
outbreak.
c) Characterization of the SRLV restriction by APOBEC3., Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología (CICYT), Programa Oficial de Doctorado en Biotecnología (RD 1393/2007), Bioteknologiako Doktoretza Programa Ofiziala (ED 1393/2007)

Background: A central nervous system (CNS) disease outbreak caused by small ruminant lentiviruses (SRLV) has triggered interest in Spain due to the rapid onset of clinical signs and relevant production losses. In a previous study on this outbreak, the role of LTR in tropism was unclear and env encoded sequences, likely involved in tropism, were not investigated. This study aimed to analyze heterogeneity of SRLV Env regions - TM amino terminal and SU V4, C4 and V5 segments - in order to assess virus compartmentalization in CNS. Results: Eight Visna (neurologically) affected sheep of the outbreak were used. Of the 350 clones obtained after PCR amplification, 142 corresponded to CNS samples (spinal cord and choroid plexus) and the remaining to mammary gland, blood cells, bronchoalveolar lavage cells and/or lung. The diversity of the env sequences from CNS was 11.1-16.1% between animals and 0.35-11.6% within each animal, except in one animal presenting two sequence types (30% diversity) in the CNS (one grouping with those of the outbreak), indicative of CNS virus sequence heterogeneity. Outbreak sequences were of genotype A, clustering per animal and compartmentalizing in the animal tissues. No CNS specific signature patterns were found. Conclusions: Bayesian approach inferences suggested that proviruses from broncoalveolar lavage cells and peripheral blood mononuclear cells represented the common ancestors (infecting viruses) in the animal and that neuroinvasion in the outbreak involved microevolution after initial infection with an A-type strain. This study demonstrates virus compartmentalization in the CNS and other body tissues in sheep presenting the neurological form of SRLV infection., This study was supported by grants from Spanish CICYT (AGL2007-66874-C04, AGL2010-22341-C04) and Government of Navarra Department of Agriculture (IIQ010449.RI1 and IIQ14064.RI1). H. Ramirez was supported by PASPA program, UNAM and Public University of Navarra.