BUSCADOR RECOLECTA

Small ruminant lentivirus (SRLV) infection causes losses in the small ruminant industry due to reduced animal production
and increased replacement rates. Infection of wild ruminants in close contact with infected domestic animals
has been proposed to play a role in SRLV epidemiology, but studies are limited and mostly involve hybrids between
wild and domestic animals. In this study, SRLV seropositive red deer, roe deer and mouflon were detected through
modified ELISA tests, but virus was not successfully amplified using a set of different PCRs. Apparent restriction of SRLV
infection in cervids was not related to the presence of neutralizing antibodies. In vitro cultured skin fibroblastic cells
from red deer and fallow deer were permissive to the SRLV entry and integration, but produced low quantities of virus.
SRLV got rapidly adapted in vitro to blood-derived macrophages and skin fibroblastic cells from red deer but not from
fallow deer. Thus, although direct detection of virus was not successfully achieved in vivo, these findings show the
potential susceptibility of wild ruminants to SRLV infection in the case of red deer and, on the other hand, an in vivo
SRLV restriction in fallow deer. Altogether these results may highlight the importance of surveilling and controlling
SRLV infection in domestic as well as in wild ruminants sharing pasture areas, and may provide new natural tools to
control SRLV spread in sheep and goats., Funded by CICYT (AGL2010-22341-C04-01 and AGL2013-49137-C3-1-R) and Navarra’s Government (IIQ010449.RI1 and IIQ14064.RI1). L. Sanjosé was a FPI fellow of the Spanish MINECO and R. Reina had contracts from the Public University of Navarra and CSIC. The auhors acknowledge support in the publication fee by the CSIC Open Access Publication Support Initiative through its Unit of Information Resources for Research (URICI).

La tutora es Inmaculada Farrán Blanch., Las plantas son metaorganismos que regulan su desarrollo y metabolismo en respuesta a diferentes estímulos externos. Conviven con microorganismos emisores de compuestos que difunden a través del suelo tales como azúcares, proteínas, exopolisacáridos, sideróforos, ácidos grasos, ácidos orgánicos, aminoácidos y hormonas que modifican la fotosíntesis, el metabolismo y el crecimiento de las plantas (Philippot et al., 2013; De-la-Peña and Loyola-Vargas, 2014; Backer et al., 2018). Los microorganismos beneficiosos también emiten compuestos volátiles (VCs) que fomentan el crecimiento, la captación de nutrientes y la fotosíntesis, modulan la arquitectura de la raíz, activan la respuesta de defensa de la planta e incrementan su resistencia al estrés salino y la sequía (Ryu et al., 2003; Zhang et al., 2008; Splivallo et al., 2009; Zhang et al., 2009; Gutiérrez-Luna et al., 2010; Kanchiswamy et al., 2015; Park et al., 2015; Ledger et al., 2016). Estudios llevados a cabo por el grupo de investigación en el que he realizado mi tesis doctoral demostraron que las bacterias y los hongos fitopatógenos también emiten VCs con propiedades bioestimulantes (Sánchez-López et al., 2016b). Cambios en el crecimiento, la fotosíntesis, el desarrollo y el metabolismo de la planta inducidos por VCs microbianos están asociados a grandes variaciones en el transcriptoma, el proteoma y el redox-proteoma de la planta (Sánchez- López et al., 2016b; Ameztoy et al., 2019, 2021). Tales variaciones sugieren que la respuesta de la planta a los VCs microbianos está regulada tanto a nivel transcripcional como no-transcripcional. Con el fin de profundizar en los mecanismos que median la relación entre la planta y los microorganismos, en este trabajo investigué el papel que juega el transportador de hexosas fosfato plastidial (GPT2) inducible por VCs en la respuesta de la planta modelo de laboratorio Arabidopsis thaliana a VCs emitidos por el hongo fitopatógeno Altenaria alternata. Además, investigué el papel que juega en dicha respuesta el residuo de cisteína 95 de la fructosa bifosfatasa plastidial (cFBP1), un enzima del ciclo de Calvin-Benson cuya actividad está sujeta a cambios en el estado redox inducibles por la luz.
En el capítulo 1 de esta tesis presento los resultados de mi investigación sobre el papel que juega GPT2 en la respuesta de las plantas a VCs microbianos. Para realizar esta investigación, analicé y comparé el crecimiento, la fotosíntesis y el proteoma de plantas wild type (WT), mutantes carentes GPT2 (gpt2-1), mutantes carentes PGI1 (pgi1-2) y doble mutante pgi1-2gpt2-1 cultivadas en presencia o ausencia de VCs fúngicos. Además, caractericé la respuesta a estos compuestos de plantas pgi1-2/gpt2-1 que expresan GPT2 bajo el control de un promotor específico de haces vasculares. Finalmente, caractericé el patrón de expresión de GPT2 en plantas que expresan el gen reportero GUS bajo la acción de la secuencia promotora de GPT2. Los resultados obtenidos mostraron que, de manera similar a lo que ocurre en plantas WT, los VCs fomentan el crecimiento, la fotosíntesis y la acumulación de citoquininas activas y almidón en plantas pgi1-2 y gpt2-1. Tal respuesta fue reducida en plantas pgi1-2gpt2-1 y se revirtió a WT al expresar GPT2 en haces vasculares. Estudios comparativos de los proteomas de plantas pgi1-2 y pgi1-2gpt2-1 mostraron que GPT2 regula la expresión de proteínas relacionadas con la fotosíntesis. Es más, los estudios de expresión mostraron que GPT2 se expresa en haces vasculares y está sujeto a complejos mecanismos de regulación. Globalmente, los resultados presentados en este capítulo indican que en condiciones en las cuales la actividad de PGI está reducida, la respuesta de la planta a VCs microbianos conlleva una regulación de la expresión de proteínas relacionadas con la fotosíntesis a través de mecanismos en los que GPT2 juega un papel importante en la provisión de sustrato necesario para la producción de citoquininas en haces vasculares.
Trabajos llevados a cabo en el grupo de investigación en el que he realizado este mi tesis mostraron que la exposición a VCs microbianos conlleva cambios globales en el redox-proteoma de las plantas (Ameztoy et al., 2019). Tales cambios incluían la reducción de residuos de cisteína altamente conservados a lo largo de la evolución de enzimas del ciclo de Calvin-Benson. En el capítulo 2 presento los resultados de mi investigación sobre el papel que juega el residuo de cisteína 95 de la cFBP1 en su actividad, en la fotosíntesis y en la respuesta de las plantas a VCs microbianos. Para realizar esta investigación, comparé las propiedades electroforéticas y cinéticas de cFBP1 WT y una forma mutada en la que el residuo de cisteína 95 fue sustituido por un residuo de serina (C95S). Además, comparé la fotosíntesis y el crecimiento de plantas de Arabidopsis cfbp1 carentes de cFBP1 endógena que expresan ectópicamente formas WT o C95S de cFBP1. Los resultados mostraron que el residuo de cisteína 95 juega un papel importante en la actividad de cFBP1 y en la fotosíntesis, pero no en el crecimiento de Arabidopsis., Beca predoctoral de la Universidad Pública de Navarra; Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN) y Agencia Estatal de Investigación (AEI)/10.13039/501100011033/(proyectos BIO2016-78747-P y PID2019-104685GB-100)., Programa de Doctorado en Biotecnología (RD 99/2011), Bioteknologiako Doktoretza Programa (ED 99/2011)

Multisystemic disease caused by Small Ruminant Lentiviruses (SRLV) in sheep and goats leads to production losses, to the detriment of animal health and welfare. This, together with the lack of treatments, has triggered interest in exploring different strategies of immunization to control the widely spread SRLV infection and, also, to provide a useful model for HIV vaccines. These strategies involve inactivated whole virus, subunit vaccines, DNA encoding viral proteins in the presence or absence of plasmids encoding immunological adjuvants and naturally or artificially attenuated viruses. In this review, we revisit, comprehensively, the immunization strategies against SRLV and analyze this double edged tool individually, as it may contribute to either controlling or enhancing virus replication and/or disease., Funded by CICYT (AGL2010-22341-C04-01) and Gobierno de Navarra (IIQ14064.RI1). RR was funded by a CSIC JAE-Doc contract.

Esta tesis doctoral ha sido realizada dentro de los siguientes proyectos de investigación: AGL2003‐08977‐C03‐01, AGL2006‐13410‐C06‐01/GAN, AGL2007‐66874‐C04‐01/GAN, AGL2010‐22341‐C04‐01, y han sido financiados por la Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología (CICYT)., Los lentivirus de pequeños rumiantes (SRLV), que incluyen al virus
Visna/Maedi (VMV) y al de la artritis encefalitis caprina (CAEV), infectan ovejas y
cabras distribuidas por todo el mundo causando un cuadro multisistémico que afecta
articulaciones, pulmones, glándula mamaria y sistema nervioso central. Las pérdidas
derivadas de la infección van desde el aumento en la tasa de reposición, a un
descenso en las producciones animales o en el valor comercial del rebaño. Aunque la
enfermedad causada por los SRLV es de carácter lento y generalmente afecta a
pulmones y glándula mamaria en nuestro país, se han descrito brotes
epidemiológicos causantes de artritis y encefalitis en ovinos que afectan un gran
número de animales, causando pérdidas directas.
En la actualidad existen 5 genotipos descritos (A‐E) que presentan una alta
variabilidad genética y biológica. Los genotipos A y B a los que pertenecen las estirpes
clásicas de VMV y CAEV respectivamente, están distribuidos mundialmente, mientras
que los genotipos C y E están restringidos a zonas geográficas concretas.
En ausencia de tratamientos o vacunas totalmente protectoras, las medidas
de control se basan en la detección temprana de animales infectados y su posterior
eliminación del rebaño. Tras la infección, los animales infectados desarrollan una
respuesta de anticuerpos que, si bien no es capaz de eliminar el virus, es indicadora
de la infección. Así, empleando métodos de detección serológica podemos
diagnosticar la infección indirectamente. Los métodos más eficaces hasta el momento
son los ELISAs basados en proteínas recombinantes y péptidos sintéticos. Sin
embargo, los métodos disponibles en el comercio están diseñados teniendo en
cuenta una única estirpe viral, que sumado a la alta variabilidad antigénica de los
SRLV, hace que las medidas disponibles fallen a la hora de controlar todo el espectro
antigénico presente.
La organización genómica de los lentivirus está bastante conservada entre los
miembros del género. Así, a los genes estructurales gag, pol y env encargados de
codificar proteínas de la cápside, proteínas para la replicación del material genético e
integración y las proteínas de la envoltura, respectivamente, hay que sumarles los
accesorios vpr, rev y vif en el caso de los SRLV, todos ellos flanqueados por el
regulador de la transcripción viral, la región LTR.
En la patogénesis de las enfermedades lentivirales es esencial conocer las
interacciones entre el virus y el hospedador que determinan el tropismo y el
desarrollo de los síntomas. Los factores virales incluyen las proteínas de la envoltura,
encargadas de unirse al receptor celular y la región LTR encargada de regular la
actividad transcripcional. Los factores del hospedador son más diversos ya que
pueden incluir todo el fondo genético de una raza o una población determinada capaz
de restringir la replicación viral de manera efectiva. Uno de los pasos clave en el
establecimiento de la infección es la superación de las barreras de la inmunidad
innata, que reconocen directamente determinantes virales e inducen la eliminación
del patógeno mediante factores de restricción como APOBEC3.
La caracterización genética y virológica de las estirpes implicadas en los brotes
epidemiológicos de artritis y encefalitis, puede aportar hallazgos esenciales en el
conocimiento de la relación entre la secuencia genética de los aislados y la capacidad
para establecer la infección en un tejido determinado. Por otro lado, componentes de
la inmunidad innata del hospedador capaces de inhibir la replicación viral pueden ser
también determinantes del tropismo.
Por todo ello en esta tesis nos planteamos los siguientes estudios:
a) Aislamiento y caracterización genética de estirpes implicadas en el brote
artrítico.
b) Aislamiento y caracterización genética de estirpes implicadas en el brote de
encefalitis.
c) Caracterización de la restricción de los SRLV por APOBEC3., Small ruminant lentiviruses (SRLV) include Visna Maedi virus (VMV) and
caprine arthritis encephalitis virus (CAEV), infect sheep and goats and are widely
distributed around the world causing a multisistemic disease of carpal joints, lungs,
mammary gland and central nervous system. Losses derived from SRLV infection
range from increased reposition rates in affected flocks to decreased animal
production and low commercial value of the flock. SRLV‐induced disease is a slow
process that affects mainly lungs and mammary gland in sheep from Spain, however
new epidemiological outbreaks of arthritis and encephalitis in sheep have affected a
high number of animals causing direct losses.
Currently, 5 genotypes (A‐E) have been described showing a high genetic and
biological variability. Genotypes A and B include classic VMV and CAEV strains
respectively, and are widely distributed whereas genotypes C and E are
geographically restricted.
In the absence of treatments or protective vaccines, control measures are
based on early detection of infected animals and culling. After infection, animals
develop an antibody response unable to control viral replication, but indicative of
viral infection. Thus, through the application of serological methods infection can be
detected. The most currently used method is ELISA based on recombinant proteins
and/or synthetic peptides. However, available tools are designed on the basis of a
single strain that, together with the high variability present in SRLV hinder the
detection of the whole SRLV antigenic spectrum.
Lentiviral genomic organization is quite conserved among viruses within the
genus. Thus, structural genes gag, pol and env encode capsid proteins, proteins that
replicate and integrate viral genome and envelope proteins, respectively, plus
accessory genes vpr, rev and vif in the case of SRLV, all of them flanked by the LTR as
transcription regulator.
Host‐virus interactions are essential in the development of lentiviral‐induced
pathogenesis finally determining tropism and disease onset. Viral factors include Env
proteins that mediate binding with cellular receptor, and the LTR region due to its
control of transcriptional activity. Host factors may include all the genetic background
belonging to a specific breed or animal population able to restrict viral replication
efficiently. Transgression of innate immune barriers responsible for the direct
recognition and elimination of the pathogen, such as APOBEC3, is one of the key
steps to overcome in the establishment of infection.
Genetic and virological characterization of the strains involved in the arthritic
and encephalitic outbreaks may provide new insights in the association between
genetics and the ability to establish a tissue targeted infection. On the other hand,
innate immunity restriction factors, able to inhibit viral replication, are also
determinants of viral tropism.
Therefore in this Thesis the following studies were conducted:
a) Isolation and genetic characterization of SRLV strains involved in the arthritic
outbreak.
b) Isolation and genetic characterization of SRLV involved in the encephalitis
outbreak.
c) Characterization of the SRLV restriction by APOBEC3., Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología (CICYT), Programa Oficial de Doctorado en Biotecnología (RD 1393/2007), Bioteknologiako Doktoretza Programa Ofiziala (ED 1393/2007)

Background: A central nervous system (CNS) disease outbreak caused by small ruminant lentiviruses (SRLV) has triggered interest in Spain due to the rapid onset of clinical signs and relevant production losses. In a previous study on this outbreak, the role of LTR in tropism was unclear and env encoded sequences, likely involved in tropism, were not investigated. This study aimed to analyze heterogeneity of SRLV Env regions - TM amino terminal and SU V4, C4 and V5 segments - in order to assess virus compartmentalization in CNS. Results: Eight Visna (neurologically) affected sheep of the outbreak were used. Of the 350 clones obtained after PCR amplification, 142 corresponded to CNS samples (spinal cord and choroid plexus) and the remaining to mammary gland, blood cells, bronchoalveolar lavage cells and/or lung. The diversity of the env sequences from CNS was 11.1-16.1% between animals and 0.35-11.6% within each animal, except in one animal presenting two sequence types (30% diversity) in the CNS (one grouping with those of the outbreak), indicative of CNS virus sequence heterogeneity. Outbreak sequences were of genotype A, clustering per animal and compartmentalizing in the animal tissues. No CNS specific signature patterns were found. Conclusions: Bayesian approach inferences suggested that proviruses from broncoalveolar lavage cells and peripheral blood mononuclear cells represented the common ancestors (infecting viruses) in the animal and that neuroinvasion in the outbreak involved microevolution after initial infection with an A-type strain. This study demonstrates virus compartmentalization in the CNS and other body tissues in sheep presenting the neurological form of SRLV infection., This study was supported by grants from Spanish CICYT (AGL2007-66874-C04, AGL2010-22341-C04) and Government of Navarra Department of Agriculture (IIQ010449.RI1 and IIQ14064.RI1). H. Ramirez was supported by PASPA program, UNAM and Public University of Navarra.

Thirty-one sheep naturally infected with small ruminant lentiviruses (SRLV) of known genotype (A or B), and clinically affected with neurological disease, pneumonia or arthritis were used to analyse mannose receptor (MR) expression (transcript levels) and proviral load in virus target tissues (lung, mammary gland, CNS and carpal joints). Control sheep were SRLV-seropositive asymptomatic (n = 3), seronegative (n = 3) or with chronic listeriosis, pseudotuberculosis or parasitic cysts (n = 1 in each case). MR expression and proviral load increased with the severity of lesions in most analyzed organs of the SRLV infected sheep and was detected in the affected tissue involved in the corresponding clinical disease (CNS, lung and carpal joint in neurological disease, pneumonia and arthritis animal groups, respectively). The increased MR expression appeared to be SRLV specific and may have a role in lentiviral pathogenesis., Funded by grants from CICYT AGL2010-22341-C04-01 and Gobierno de Navarra IIQ14064.RI1. We acknowledge the Public University of
Navarra and CSIC for fellowships and the JAE-contract (HC and RR).

Small ruminant lentiviruses (SRLV) infect the monocyte/macrophage lineage inducing a long-lasting infection affecting body condition, production and welfare of sheep and goats all over the world. Macrophages play a pivotal role on the host's innate and adaptative immune responses against parasites by becoming differentially activated. Macrophage heterogeneity can tentatively be classified into classically differentiated macrophages (M1) through stimulation with IFN-gamma displaying an inflammatory profile, or can be alternatively differentiated by stimulation with IL-4/IL-13 into M2 macrophages with homeostatic functions. Since infection by SRLV can modulate macrophage functions we explored here whether ovine and caprine macrophages can be segregated into M1 and M2 populations and whether this differential polarization represents differential susceptibility to SRLV infection. We found that like in human and mouse systems, ovine and caprine macrophages can be differentiated with particular stimuli into M1/M2 subpopulations displaying specific markers. In addition, small ruminant macrophages are plastic since M1 differentiated macrophages can express M2 markers when the stimulus changes from IFN-gamma to IL-4. SRLV replication was restricted in M1 macrophages and increased in M2 differentiated macrophages respectively according to viral production. Identification of the infection pathways in macrophage populations may provide new targets for eliciting appropriate immune responses against SRLV infection., This work was funded by grants from CICYT (no. AGL2010-22341-C04-01), and the Government of Navarra (no. IIQ14064.RI1). We acknowledge the Public University of Navarra and CSIC for fellowships and the JAE-contract (HC and RR).

Thirty-one sheep naturally infected with small ruminant lentiviruses (SRLV) of known genotype (A or B), and clinically affected with neurological disease, pneumonia or arthritis were used to analyse mannose receptor (MR) expression (transcript levels) and proviral load in virus target tissues (lung, mammary gland, CNS and carpal joints). Control sheep were SRLV-seropositive asymptomatic (n¿=¿3), seronegative (n¿=¿3) or with chronic listeriosis, pseudotuberculosis or parasitic cysts (n¿=¿1 in each case). MR expression and proviral load increased with the severity of lesions in most analyzed organs of the SRLV infected sheep and was detected in the affected tissue involved in the corresponding clinical disease (CNS, lung and carpal joint in neurological disease, pneumonia and arthritis animal groups, respectively). The increased MR expression appeared to be SRLV specific and may have a role in lentiviral pathogenesis.