La brucelosis es una zoonosis extendida mundialmente con importantes repercusiones económicas y sanitarias, cuya principal fuente de infección para el ser humano son los pequeños rumiantes infectados por Brucella melitensis. En gran parte del mundo, el control de la brucelosis en estos animales debe basarse en la vacunación. B. melitensis Rev1 es la única vacuna disponible y recomendada internacionalmente para ovejas y cabras. Sin embargo, la vacunación con Rev1 genera una interferencia serológica que impide la Diferenciación entre Animales Infectados y Vacunados (DIVA), limitando el uso de esta cepa vacunal. Para tratar de solventar el problema DIVA, se ha desarrollado una técnica de marcaje xenogénico con la proteína de origen marino GFP. En el capítulo 1 de esta tesis, se obtuvieron dos isoformas de GFP recombinante y se desarrollaron tests serológicos utilizando dichas proteínas como antígeno diagnóstico. En el capítulo 2, se realizó el marcaje xenogénico de Rev1 con gfp mediante la inserción cromosómica dirigida de un mini-Tn7-gfp (Rev1::gfp) y un análisis serológico detallado, tanto en ratones BALB/c como en ganado ovino. La estrategia de vacunación con Rev1::gfp en mezcla con GFP y un booster posterior con GFP en hidróxido de aluminio, permitió identificar durante más de 6 meses post-booster a todos los animales que habían sido vacunados, utilizando las técnicas serológicas oficiales anti-LPS-S y un iELISA-GFP. Además, la vacuna clásica Rev1 posee otros inconvenientes como son su poder patógeno residual y resistencia a la estreptomicina, que recomiendan la búsqueda de nuevas vacunas frente a B. melitensis. Para ello, en el capítulo 3 se construyeron y caracterizaron los candidatos vacunales 16Δ.wzm y 16Δ.wzm::gfp, con LPS-R, a la vez que acumulan PS-0 en el interior bacteriano, y sensibles a estreptomicina. Estas propiedades confirieron una atenuación y eficacia frente a B. melitensis en ratones similares a las de Rev1. En corderos, la vacunación combinada de 16Δ.wzm::gfp con GFP generó una mínima interferencia en las pruebas convencionales con LPS-S y permitió identificar a los anímales vacunados mediante iELISA-GFP, sin necesidad de booster. Por otra parte, Rev1 ha permitido controlar la infección por Brucella ovis. En las zonas donde se ha abandonado la vacunación con Rev1, B. ovis es una patógeno emergente que causa graves pérdidas económicas. Puesto que no existe una vacuna específica frente a B. ovis, el capítulo 4 se centró en analizar las propiedades vacunales de una selección de cinco mutantes rugosos de B. melitensis obtenidos en un proyecto anterior, mediante inserción aleatoria del mini-Tn5. De ellos, se seleccionaron y construyeron por deleción en fase las cepas marcadas 16Δ.wzm::gfp (capítulo 3) y H38ΔwbkF::gfp (capítulo 4). Además, se seleccionó un mutante de B. ovis PA que había mostrado buenas propiedades en el modelo murino en un trabajo anterior, para su marcaje con el mini-Tn7-gfp, generando la cepa BoPAiΔomp10ΔugpBΔomp31::gfp. La vacunación con una de estas cepas marcadas, tanto por vía intraperitoneal como subcutánea, evidenció mejor protección con los mutantes de B. melitensis que con el triple mutante de B. avis en el modelo murino. Finalmente, se evaluó la inocuidad y respuesta serológica de 16MΔwzm::gfp y BoPAΔomp10iΔugpBfΔomp31::gfp en ganado ovino, tras la vacunación combinada del mutante con GFP y posterior booster con GFP en hidróxido de aluminio, siguiendo el protocolo descrito en el Capítulo 2. Al igual que con Rev1::gfp, esta estrategia permitió identificar por iELISA-GFP a todos los animales que habían sido vacunados, durante más de 4 meses post-booster. En conjunto, por un lado, el marcaje de Brucella con el mini-Tn7-gfp permitió conservar las propiedades microbiológicas y vacunales que poseían los correspondientes mutantes antes de ser marcados y, a su vez, permitió identificarlos fácilmente por visualización directa de la ftuorescencia y por una PCR-GFP múltiple específicamente diseñada. Por otro lado, Rev1::gfp y 16MΔwzm::gfp parecen buenas alternativas a Rev1 frente a infecciones por B. melitensis virulentas., La realización de esta tesis doctoral ha sido posible gracias a la beca predoctoral del programa Ayudas para Formación de Personal Investigador Predoctoral de la Universidad Pública de Navarra UPNA y disfrutada en el Instituto de Agrobiotecnología IdAB (Centro Mixto del CSIC, la UPNA y el Gobierno de Navarra). Los trabajos realizados han sido financiados por los proyectos de investigación del Ministerio de Economía, Industria y Competitividad proyectos AGL2010-20247 y AGL2011-30453-C04-01) y la colaboración bilateral CSIC - Fundación CRUSA (proyectos 2008CR0006 y 2010CR0005)., Programa de Doctorado en Biotecnología (RD 99/2011), Bioteknologiako Doktoretza Programa (ED 99/2011)

Brucellosis is a zoonosis caused by Brucella species. Brucellosis research in natural hosts is often precluded by practical, economical and ethical reasons and mice are widely used. However, mice are not natural Brucella hosts and the course of murine brucellosis depends on bacterial strain virulence, dose and inoculation route as well as breed, genetic background, age, sex and physiological statu of mice. Therefore, meaningful experiments require a definition of these variables. Brucella spleen replication profiles are highly reproducible and course in four phases: i), onset or spleen colonization (first 48h); ii), acute phase, from the third day to the time when bacteria reach maximal numbers; iii), chronic steady phase, where bacterial numbers plateaus; and iv), chronic declining phase, during which brucellae are eliminated. This pattern displays clear physiopathological signs and is sensitive to small virulence variations, making possible to assess attenuation when fully virulent bacteria are used as controls. Similarly, immunity studies using mice with known defects are possible. Mutations affecting INF-gamma, TLR9, Myd88, Tgammadelta and TNF-beta favor Brucella replication; whereas IL-1beta, IL-18, TLR4, TLR5, TLR2, NOD1, NOD2, GM-CSF, IL/17r, Rip2, TRIF, NK or Nramp1 deficiencies have no noticeable effects. Splenomegaly development is also useful: it correlates with IFN-gamma and IL-12 levels and with Brucella strain virulence. The genetic background is also important: Brucella-resistant mice (C57BL) yield lower splenic bacterial replication and less splenomegaly than susceptible breeds. When inoculum is increased, a saturating dose above which bacterial numbers per organ do not augment, is reached. Unlike many gram-negative bacteria, lethal doses are large (greater than or equal to] 108 bacteria/mouse) and normally higher than the saturating dose. Persistence is a useful virulence/attenuation index and is used in vaccine (Residual Virulence) quality control. Vaccine candidates are also often tested in mice by determining splenic Brucella numbers after challenging with appropriate virulent brucellae doses at precise post-vaccination times. Since most live or killed Brucella vaccines provide some protection in mice, controls immunized with reference vaccines (S19 or Rev1) are critical. Finally, mice have been successfully used to evaluate brucellosis therapies. It is concluded that, when used properly, the mouse is a valuable brucellosis model., This work was performed under agreement contract
2010020113, subscribed by UNA from Costa Rica and, CSIC, CITA, and UN
from Spain. This work was funded by grants FIDA-2009 UNA, FS-CONARE
UNA/UCR, NeTropica 8, and MICIT/CONICIT, CSIC-CRUSA (2010CR0005) from
Costa Rica; and CICYT-MICINN (AGL2010-20247, AGL2008-04514-C03-00 and
AGL2011-30453-C04-00) projects from Spain and grant ANR2010BLAN1308
Brutir., form France. This work was done as part of the UCR/DAAD Humboldt
Fellow award 2012 to EM.

Brucella melitensis Rev 1 is the best vaccine available for the prophylaxis of small ruminant brucellosis and, indirectly, for reducing human brucellosis. However, Rev 1 shows anomalously high rates of spontaneous dissociation from smooth (S) to rough (R) bacteria, the latter being inefficacious as vaccines. This S-R instability results from the loss of the O-polysaccharide. To overcome this problem, we investigated whether some recently described mechanisms promoting mutations in O-polysaccharide genes were involved in Rev 1 S-R dissociation. We found that a proportion of Rev 1 R mutants result from genome rearrangements affecting the wbo O-polysaccharide loci of genomic island GI-2 and the wbkA O-polysaccharide glycosyltransferase gene of the wbk region. Accordingly, we mutated the GI-2 int gene and the wbk IS transposase involved in those arrangements, and found that these Rev 1 mutants maintained the S phenotype and showed lower dissociation levels. Combining these two mutations resulted in a strain (Rev 2) displaying a 95% decrease in dissociation with respect to parental Rev 1 under conditions promoting dissociation. Rev 2 did not differ from Rev 1 in the characteristics used in Rev 1 typing (growth rate, colonial size, reactivity with O-polysaccharide antibodies, phage, dye and antibiotic susceptibility). Moreover, Rev 2 and Rev 1 showed similar attenuation and afforded similar protection in the mouse model of brucellosis vaccines. We conclude that mutations targeting genes and DNA sequences involved in spontaneous O-polysaccharide loss enhance the stability of a critical vaccine phenotype and complement the empirical stabilization precautions taken during S Brucella vaccine production., This work was funded by MINECO (reference project AGL2011-30453-C04) of
Spain, the FIMA foundation and the European Union’s FP7/2007-2013 (grant
agreement n° 221948, ICONZ - Integrated control of Neglected Zoonoses)
and CSIC JAE-Doc program (FSE).

Incluye 1 fichero de datos, Brucella spp. are Gram-negative bacteria that behave as facultative intracellular parasites of a variety of mammals. This genus includes smooth (S) and rough (R) species that carry S and R lipopolysaccharides (LPS), respectively. S-LPS is a virulence factor, and mutants affected in the S-LPS O-polysaccharide (R mutants), core oligosaccharide or both show attenuation. However, B. ovis is naturally R and is virulent in sheep. We studied the role of B. ovis LPS in virulence by mutating the orthologues of wadA, wadB and wadC, three genes known to encode LPS core glycosyltransferases in S brucellae. When mapped with antibodies to outer membrane proteins (Omps) and R-LPS, wadB and wadC mutants displayed defects in LPS structure and outer membrane topology but inactivation of wadA had little or no effect. Consistent with these observations, the wadB and wadC but not the wadA mutants were attenuated in mice. When tested as vaccines, the wadB and wadC mutants protected mice against B. ovis challenge. The results demonstrate that the LPS core is a structure essential for survival in vivo not only of S brucellae but also of a naturally R Brucella pathogenic species, and they confirm our previous hypothesis that the Brucella LPS core is a target for vaccine development. Since vaccine B. melitensis Rev 1 is S and thus interferes in serological testing for S brucellae, wadB mutant represents a candidate vaccine to be evaluated against B. ovis infection of sheep suitable for areas free of B. melitensis., This work was funded by Ministerio de Economía y Competitividad of Spain (reference project AGL2011-30453-C04) and Fundación para la Investigación
Médica Aplicada (FIMA). Financial support to PS-L from Ministerio de Economía y Competitividad of Spain (reference BES-2009-015656), AZ-B from Universidad
Pública de Navarra, and BSR from CSIC and European Social Fund (Programa JAE-Doc) are also gratefully acknowledged.